[發明專利]一種牡蠣皰疹病毒不同變異株的巢式PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201610052695.7
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105543415A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 白昌明;王崇明;高文輝;汪清晨;史杰;張慶利
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于貝類病原檢測技術領域，具體涉及一種通過巢式聚合酶鏈式反應 (PolymeraseChainReaction,PCR)檢測牡蠣皰疹病毒(Ostreidherpesvirus1,OsHV-1)的 方法。

背景技術

自20世紀90年代末以來，OsHV-1引起包括我國在內的全球11個國家和地區海水 養殖雙殼貝類的大規模死亡。目前已知受影響的宿主物種包括牡蠣(6種)，扇貝(2種)， 蛤類(2種)和魁蚶在內的11個物種；其中受影響最嚴重的是我國養殖的櫛孔扇貝 (Chlamysfarreri)和歐洲養殖的長牡蠣(Crassostreagigas)。建立準確、靈敏和快速的檢 測方法是及早發現病害病原并采取相應防控措施前提和基礎。

目前對于OsHV-1的檢測，最常用的方法是聚合酶鏈式反應(PCR)技術；PCR所 采用的引物多是基于病毒基因組C區設計的，其中基于C2和C6位點設計的一對引物， 被OIE推薦為該病毒的PCR檢測的通用方法，該方法已被多個國家和地區廣泛采用。 然而最新的比較基因組學分析結果表明，C區是牡蠣皰疹病毒基因組中序列變異最大的 幾個基因片段之一。同時近年來OsHV-1分子流行病學監測數據和研究結果表明，該病 毒2008年以來發生了較強的株系分化；因基因組C區堿基組成或排列順序發生變異而 產生的新變異株不斷出現，從而導致基于該區核苷酸序列設計的OsHV-1檢測引物無法 與目標位點結合；最終導致基于C區建立的多種普通和巢式PCR檢測方法，不能準確 檢出部分OsHV-1變異株感染的存在。

發明內容

本發明的目的是提供一種牡蠣皰疹病毒不同變異株的巢式PCR檢測方法，可以彌 補現有檢測技術只能對部分病毒變異株進行檢測的不足，使牡蠣皰疹病毒的檢測更準確 和靈敏；可用于雙殼貝類各時期養殖過程中牡蠣皰疹病毒的跟蹤檢測。

本發明首先提供一種檢測牡蠣皰疹病毒的巢式PCR檢測引物，

Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇(SEQIDNO:1)、

Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇(SEQIDNO:2)、

nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇(SEQIDNO:3)、

nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇(SEQIDNO:4)；

本發明另一個方面提供一種牡蠣皰疹病毒的巢式PCR檢測方法，即首先從待檢測 樣品中制備反應模板，并配制巢式PCR反應體系，然后通過巢式PCR反應程序對反應 模板進行擴增，最后根據PCR產物瓊脂糖凝膠電泳是否產生目的條帶對檢測結果進行判 斷，如果顯示目的條帶則表示該樣品的牡蠣皰疹病毒檢測結果為陽性；

具體包括如下的步驟：

步驟1)基因組DNA提取：采用普通動物組織的DNA提取方法，從約30mg的貝 類樣本外套膜組織中提取DNA；

步驟2)第一輪PCR擴增：以步驟1)中得到的樣本DNA2.0μL為模板，采用 Pol-F/Pol-R引物，經PCR擴增得到第一輪PCR擴增產物。

步驟3)第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產物10倍稀釋物2.0μL為模板，采 用nPol-F/nPol-R引物，經PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物。

步驟4)PCR擴增產物檢測：取4.5μL第二輪PCR擴增產物，加入1.5μL的上樣 緩沖液(GeneFinder與6×loadingbuffer按1∶9體積混合)混合后，在濃度為1％的瓊脂糖 凝膠中，110伏電壓下電泳30min；凝膠成像系統觀察并拍照，存在約386bp的特異性 條帶，則確定所檢測的樣本被OsHV-1所感染。

其中步驟2)所用PCR反應體系為：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer 5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL，Mg²⁺(25mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L) 各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超純水30.6μL補齊到50μL的反應體系。