[發明專利]一種牡蠣皰疹病毒不同變異株的巢式PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201610052695.7
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105543415A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 白昌明;王崇明;高文輝;汪清晨;史杰;張慶利
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種檢測牡蠣皰疹病毒的巢式PCR引物組，其特征在于，所述的 引物組的信息如下：

Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇、

Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇、

nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇、

nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇。

2.權利要求1所述的巢式PCR引物組在制備檢測牡蠣皰疹病毒的制 品中的應用。

3.一種檢測牡蠣皰疹病毒的方法，其特征在于，所述的方法使用權 利要求1所述的巢式PCR引物組。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法首先從待檢 測樣品中制備反應模板，并配制巢式PCR反應體系，然后通過巢式PCR 反應程序對反應模板進行擴增，最后根據PCR產物瓊脂糖凝膠電泳是否產 生目的條帶對檢測結果進行判斷，如果顯示目的條帶則表示該樣品的牡蠣 皰疹病毒檢測結果為陽性。

5.如權利要求4所述的方法，包含有如下的步驟：

1)基因組DNA提取：采用普通動物組織的DNA提取方法，從待檢 測的樣品中提取DNA；

2)第一輪PCR擴增：

以步驟1)中得到的樣本DNA為模板，采用Pol-F/Pol-R引物，經PCR 擴增得到第一輪PCR擴增產物；

3)第二輪PCR擴增：

以第一輪PCR擴增產物10倍稀釋物為模板，采用nPol-F/nPol-R引 物，經PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物；

4)PCR擴增產物檢測：

取第二輪PCR擴增產物進行電泳，如存在386bp的特異性條帶，則 確定所檢測的樣本被OsHV-1所感染。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)所用PCR 反應體系為：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs (2.5mmol/L)4.0μL，Mg²⁺(25mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L) 各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超純水30.6μL補齊到50μL的反應體 系。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)所用PCR 反應程序為：首先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，53℃變性30 s，72℃延伸45s，35個循環；最后72℃延伸10min，4℃保存。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)所用PCR 反應體系為：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs (2.5mmol/L)3.0μL，Mg²⁺(25.0mmol/L)3.0μL，上下游引物(10.0μmol/L) 各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超純水32.6μL補齊到50μL的反應體 系。

9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)所用PCR 反應程序為：首先94℃預變性5min；然后94℃變性30s，51℃變性30 s，72℃延伸45s，25個循環；最后72℃延伸10min，4℃保存。