[發明專利]多功能熒光蛋白納米線及其介導的免疫分析方法

在審

• 申請號: 201610051566.6
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105652015A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 門冬;張先恩;周娟;張治平
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/62;C12N15/63;C07K19/00
• 代理公司: 北京布瑞知識產權代理有限公司 11505
• 代理人: 張丹

技術領域

本發明涉及免疫分析領域，特別涉及一種多功能熒光蛋白納米線及其介導的 免疫分析方法。

背景技術

蛋白微陣列分析(ProteinMicroarray)技術又稱蛋白芯片技術，可用于大規 模蛋白質相互作用篩查、高通量靶標蛋白檢測、各種蛋白質譜學分析、蛋白-核 酸相互作用分析、蛋白質-小分子(藥物篩選)相互作用分析等。其基本原理類 似于酶聯免疫吸附分析(ELISA)，將大量不同的目標蛋白按照指定順序固定于 固相載體(玻片、云母)表面，通過熒光標記抗體或相互作用分子指示靶標蛋白 的位置，從而獲取相互作用的信息。蛋白芯片技術使得復雜相互作用網絡的構建 和多目標分子同時檢測成為現實。

傳統的蛋白芯片是通過在抗體或相互作用分子的表面修飾熒光分子來進行 信號輸出，其修飾的熒光分子數量有限，過多的熒光分子修飾也會影響抗體或相 互作用分子的結合能力，這限制了蛋白芯片靈敏度的提高。隨著技術的發展，常 規蛋白芯片的分析靈敏度1-100ng/mL(EspinaV等，Proteinmicroarraydetection strategies:focusondirectdetectiontechnologies，J.Immunol.Methods.290， 121–133，2004.)已經無法滿足臨床檢測和科學研究需求，亟需高靈敏的蛋白芯 片檢測技術。

現有蛋白芯片的熒光檢測信號放大方法主要包括：

(1)銀染增強(CN101539573、CN1743845A)，通過在特異性結合分子標 記的納米金的表面進行銀離子的還原，從而使標記的納米金信號增強，是一種基 于化學反應的信號擴增方法；然而，銀染增強的方法過程復雜，容易產生較強的 背景信號，靈敏度提升有限。

(2)量子點(MeiHu等，Ultrasensitive,MultiplexedDetectionofCancer BiomarkersDirectlyinSerumbyUsingaQuantumDot-BasedMicrofluidicProtein Chip，ACSNano.2010.Jan；4(1):488-494.)，該方法利用量子點本身較好的熒光 性質，將其標記在抗體等特異性結合分子上，從而提高蛋白芯片的熒光信號響應； 然而，量子點修飾過程復雜，容易發生熒光淬滅，批量生產的質控困難，且成本 高昂，至今未進入大規模的商業化生產。

(3)碳納米管介導的拉曼增強(BeausoleilSA等，Aprobability-based approachforhigh-throughputproteinphosphorylationanalysisandsitelocalization， NatBiotechnol.2008.Nov；26(11):1285-92.)，通過在碳納米管的表面反復還原 金和銀，形成粗糙的金屬表面，從而得到表面增強拉曼信號，用于蛋白芯片檢測 的信號放大；然而，碳納米管拉曼標記的制備、標記過程復雜，需要專用的儀器， 方法不通用。

(4)病毒載體介導的熒光信號放大(KimE.Sapsford等，Acowpeamosaic virusnanoscaffoldformultiplexedantibodyconjugation:Applicationasan immunoassaytracer，BiosensBioelectron.2006,21(8):1668-1673.)，利用病毒顆 粒較大的比表面積和豐富的表面反應基團，同時修飾抗體和熒光染料，通過病毒 顆粒本身來結合大量的熒光分子，從而在結合目標分子時提高熒光分子的數量來 達到信號放大的目的；然而，病毒載體介導的熒光信號放大方法靈敏度提升有限， 且制備過程復雜，不可控。

上述現有技術中，無論是通過提高標記分子的熒光強度(或通過化學反應來 提高標記信號強度)還是提高標記熒光分子數量來放大蛋白芯片的信號，均存在 靈敏度提升不足、制備復雜、成本高等缺陷。

發明內容

本發明為克服現有技術中免疫檢測尤其是蛋白芯片檢測靈敏度不足、制備復 雜等缺點，提供一種多功能熒光蛋白納米線及其介導的免疫分析信號放大方法， 以熒光分子作為信號分子，在位于多功能熒光蛋白納米線兩端的熒光分子表面修 飾功能配體作為結合分子，可用于提高免疫檢測靈敏度。

為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：