[發(fā)明專利]多功能熒光蛋白納米線及其介導的免疫分析方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610051566.6
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105652015A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 門冬;張先恩;周娟;張治平
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/62;C12N15/63;C07K19/00
• 代理公司: 北京布瑞知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11505
• 代理人: 張丹

1.一種多功能熒光蛋白納米線，包括蛋白納米線以及連接在蛋白納米線外側(cè) 的熒光分子，其中，所述蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，至少一個所述熒 光分子表面連接功能配體，至少一個所述熒光分子表面未連接功能配體。

2.如權(quán)利要求1所述的多功能熒光蛋白納米線，其特征在于：所述成線蛋白 為酵母朊蛋白，所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠 色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素。

3.如權(quán)利要求1或2所述的多功能熒光蛋白納米線，其特征在于：表面連接 功能配體的熒光分子位于靠近蛋白納米線端部的位置，且其數(shù)量小于表面未連接 功能配體的熒光分子的數(shù)量。

4.一種如權(quán)利要求1-3任一項所述的多功能熒光蛋白納米線的制備方法，包 括如下步驟：

(1)通過分子克隆將成線蛋白的自組裝結(jié)構(gòu)域與熒光分子融合形成融合蛋 白基因LP-FP；

(2)通過分子克隆將成線蛋白自組裝結(jié)構(gòu)域與熒光分子融合后，在熒光分 子末端連接功能配體，形成融合蛋白基因LP-L；

(3)將步驟(1)和步驟(2)得到的融合蛋白基因LP-FP及LP-L分別經(jīng) 表達純化得到融合蛋白LP-FP及LP-L；

(4)將步驟(3)得到的融合蛋白LP-FP及LP-L通過自組裝形成多功能熒 光蛋白納米線。

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述成線蛋白為酵母朊蛋白， 所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠色熒光蛋白表面 通過遺傳修飾連接生物素，所述多功能熒光蛋白納米線的制備包括如下步驟：

(1)通過分子克隆將酵母朊蛋白的自組裝結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白融合形成 融合蛋白基因Sup35-GFP；

(2)通過分子克隆將酵母朊蛋白的自組裝結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白融合后， 在綠色熒光蛋白C端連接生物素接受多肽BAP，形成融合蛋白基因Sup35-BAP；

(3)將步驟(1)和步驟(2)得到的融合蛋白基因Sup35-GFP和Sup35-BAP 分別經(jīng)表達純化得到融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白；

(4)將步驟(3)得到的融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋 白通過自組裝形成多功能熒光蛋白納米線。

6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中融合蛋白 基因Sup35-BAP經(jīng)表達純化后得到生物素化的Sup35-BAP蛋白具體包括：

將融合蛋白基因Sup35-BAP克隆入表達載體，將生物素蛋白連接酶克隆入 共表達載體中；

將所述表達載體、共表達載體轉(zhuǎn)入表達宿主中培養(yǎng)，活化至對數(shù)生長期后 加入誘導表白蛋白和生物素；

經(jīng)破碎、純化后制得生物素化的綠色熒光蛋白。

7.如權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(4)中將融 合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白通過自組裝形成多功能熒光蛋 白納米線具體包括：

將融合蛋白Sup35-GFP置于4℃下孵育一周后，形成納米線，通過超聲將 納米線破碎為納米線片段，制備Sup35-GFP種子；

將制備好的Sup35-GFP種子與融合蛋白Sup35-GFP按照摩爾比為1:1-16混 合，于4℃下孵育6-10小時，進行種子誘導自組裝；

將反應(yīng)產(chǎn)物與生物素化的Sup35-BAP蛋白按摩爾比為1:1-4混合后，4℃下 離心、重懸得到多功能熒光蛋白納米線。

8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：所述Sup35-GFP種子與融 合蛋白Sup35-GFP按照摩爾比為1:2-8混合，優(yōu)選為1:4混合；和/或，

將反應(yīng)產(chǎn)物與生物素化的Sup35-BAP蛋白按摩爾比為1:1混合，4℃下離心 5-15min，優(yōu)選離心10min，重懸得到多功能熒光蛋白納米線。