[發明專利]一種同時檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法

有效

• 申請號: 201610051386.8
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105567827B
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 顧澤茂;李丹;柳陽;郭慶祥
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種非疾病診斷目的同時檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法。針對四種粘孢子蟲的18S rRNA、ITS1?5.8S?ITS2及28S rRNA基因，經過比對、分析與篩選，最終得到四對特異性引物；然后將四對引物放在一個PCR反應體系中，優化反應的退火溫度、反應試劑及引物之間的平衡濃度，建立直接從樣品中一次檢測四種粘孢子蟲的PCR方法。該方法既可以早期階段檢測粘孢子蟲，還可以對粘孢子蟲混合感染情況進行分析，具有較高的特異性與靈敏性，操作簡便，快速準確。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種非疾病診斷目的同時檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法。

背景技術

粘孢子蟲(Myxosporeans)是一類世界分布的后生動物寄生蟲，屬于粘體動物門，除少數種類寄生于兩棲類、爬行類、鳥類，甚至哺乳類外，大部分寄生于魚類，其中部分種類能導致養殖魚類重大病害的發生，造成嚴重的經濟損失與生態污染。異育銀鯽是我國重要的淡水經濟養殖魚類，近年來，隨著新品系的成功培育及養殖技術的推廣，其養殖規模不斷擴大，但隨之而來的病害也日趨嚴重，病害問題已成為制約異育銀鯽產業健康發展的瓶頸因素。

洪湖碘泡蟲、武漢單極蟲、吳李碘泡蟲、丑陋圓形碘泡蟲是危害異育銀鯽養殖最為嚴重的粘孢子蟲。洪湖碘泡蟲(Myxobolus honhuensis)是異育銀鯽“喉孢子蟲病”病原體，主要危害異育銀鯽的苗種培育，其靶組織為魚體咽部，病害爆發后在咽部形成肉眼可見的孢囊，魚體主要癥狀為不食、游動遲緩、咽部腫脹、鰓蓋外翻、眼球外凸、出血等，每年5-10月為流行季節，5-7月為病害高發期，感染率可達60％，最高死亡率可達100％；武漢單極蟲(Thelohanellus wuhanensis)是異育銀鯽“膚孢子蟲病”病原體，主要危害異育銀鯽的苗種培育，能與洪湖碘泡蟲同期感染，其靶組織為魚體體表，在體表形成肉眼可見的小孢囊，使魚體消瘦，畸形，生長緩慢，甚至大規模死亡，對苗種培育造成巨大的經濟損失；吳李碘泡蟲(M.wulii)是“腹孢子蟲病”病原體，主要寄生于魚體的肝胰臟，形成肉眼可見的大孢囊，患病魚表現為腹部膨大，內臟萎縮，肝胰臟組織結構被嚴重破壞，甚至被孢囊完全代替，最終導致魚體的死亡；丑陋圓形碘泡蟲(M.turpisrotundus)主要寄生于異育銀鯽的鰓蓋、鰓弓、口腔內外、鰭條等多個器官組織內，形成大小不一的肉眼可見孢囊，患病魚死亡率不高，但嚴重影響商品魚的經濟價值。

粘孢子蟲具有復雜的生活史，研究表明粘孢子蟲在魚體中的發育一般要經過營養體和成熟孢子(孢囊)階段。在我國，粘孢子蟲病的檢測主要以顯微鏡下可見成熟孢子、肉眼可見孢囊為依據，而一旦粘孢子蟲在魚體內形成成熟的孢子或孢囊，沒有任何有效藥物能夠滲入成熟孢子堅硬的幾丁質外殼。因此，有必要建立一種簡單快速的早期檢測方法，在粘孢子蟲的營養體階段進行藥物防治，有效地防控粘孢子蟲病的病害。

在粘孢子蟲的檢測方面，以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎的形態學檢測方法，雖然操作簡便，但存在檢測滯后、費時費力、效率低、易于漏檢等問題；以抗原與抗體反應為基礎的免疫學檢測方法，雖然具有靈敏性高、能進行早期檢測的特點，但由于粘孢子蟲生活史中存在期、屬特異性抗原以及共同抗原，交叉反應嚴重，增加了種特異性檢測的難度；以PCR技術為基礎的分子生物學檢測方法具有較高的特異性與靈敏性，已經被廣泛運用于寄生蟲的早期檢測中。

多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術，可用于同時檢測多種病原體。該方法不僅能早期檢測，靈敏性高，特異性強，而且同普通PCR方法相比具有省時省力、簡單快速等優點。目前，國內外尚無同時對異育銀鯽寄生的多種粘孢子蟲進行早期檢測的報道。

發明內容

鑒于異育銀鯽寄生粘孢子蟲早期檢測方法的缺乏，本發明提供一種同時檢測四種寄生于異育銀鯽的粘孢子蟲的PCR方法，該方法靈敏性高，特異性強，操作簡單，有利于異育銀鯽的養殖，能夠產生顯著的經濟效益。