[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610051386.8
• 申請(qǐng)日: 2016-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN105567827B
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧澤茂;李丹;柳陽(yáng);郭慶祥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 武漢開元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

1.一種非疾病診斷目的同時(shí)檢測(cè)異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)DNA提取：剪取異育銀鯽皮膚、鰓、咽及肝胰臟四個(gè)部位的部分組織，混合后置于研缽中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取組織樣品DNA；

(2)特異性DNA片段擴(kuò)增：分別以丑陋圓形碘泡蟲的18S rRNA、吳李碘泡蟲與洪湖碘泡蟲的ITS1-5.8S-ITS2、武漢單極蟲的28S rRNA基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，分別命名為Mt18S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R；將四對(duì)引物置于單個(gè)PCR反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增四種粘孢子蟲的特異性基因片段；

(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行結(jié)果判定，其中：擴(kuò)增出894bp條帶的是丑陋圓形碘泡蟲，590bp的是吳李碘泡蟲，447bp的是洪湖碘泡蟲，245bp的是武漢單極蟲，

所述的四對(duì)特異性引物序列分別為：

Mt18S F：5’-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3’

Mt18S R：5’-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3’

MwITS F：5’-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3’

MwITS R：5’-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3’

MhITS F：5’-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3’

MhITS R：5’-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3’

Tw28S F：5’-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3’

Tw28S R：5’-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR方法，其特征在于：步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系為：

DNA擴(kuò)增模板2μL、10×PCR Buffer 2.5μL、25mM Mg²⁺3.0μL、2.5mM dNTPs4μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，Mt18S F/R各0.8μL、MwITS F/R各0.4μL、MhITS F/R各0.6μL、Tw28S F/R各0.4μL，滅菌ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR方法，其特征在于：步驟(2)中的PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸70s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

4.權(quán)利要求1中所述的四對(duì)特異性引物用于制備同時(shí)檢測(cè)異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR檢測(cè)試劑盒的用途。