[發(fā)明專利]一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610051268.7
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105638476B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發(fā)明（設計）人: 涂藝聲;葉麗婻;黃倩;余曉;袁慧慧;陳曼
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所36122
• 代理人: 夏材祥

技術領域

本發(fā)明涉及一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法，即離體誘導和篩選高產石杉堿甲的蛇足石杉葉狀體株系的方法,屬于植物生物技術領域。

背景技術

蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb．ex Murray) Trev．，又名千層塔、蛇足石松、蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內首次報道該植物中的生物堿- 石杉堿甲( hupenine A, Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發(fā)現(xiàn)該生物堿是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強大的抑制作用，使分布區(qū)內神經突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強神經元興奮傳導，強化學習與記憶腦區(qū)的興奮作用，起到提高認知功能、增強記憶保持和促進記憶再現(xiàn)的作用，它是目前國內最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)的藥物。隨著老年化社會到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)已成為人類的第四大病魔，蛇足石杉是我國特有植物，由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林,生境條件特殊，很難解決石杉科植物大面積的人工栽培。近年來人們大量挖采掠奪野生資源，直接導致國際市場上Hup-A的供應缺口加大，自然千層塔資源匱乏凸顯。

自2012年本專利發(fā)明人離體培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體成功以來，深入廣泛開展研究，發(fā)明了“一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養(yǎng)方法”和“一種產石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系”，利用上述專利技術又發(fā)明了“一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法”，利用本項發(fā)明轉化生產應用可獲得大量的蛇足石杉葉狀體高產石杉堿甲藥物的植物資源，將產生極其重大的經濟價值。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法。

本發(fā)明所述方法步驟如下：

（1）所用材料：材料為離體培養(yǎng)建立的蛇足石杉葉狀體組織塊,該材料制備方法已申請專利,(專利號ZL201210005499.6，專利名稱 “一種產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養(yǎng)方法”),上述專利的發(fā)明人即本專利的發(fā)明人；

（2）葉狀體組織塊分割：在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用；

（3）誘導葉狀體：將單片葉狀體分別置于3%--6%雙氧水中，浸泡7～15 min，棄雙氧水處理液，然后用無菌水重復多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

（4）葉狀體株系恢復生長過程：誘導材料接種在繼代培養(yǎng)基上第三天至第十五天葉狀體幾乎全變白色，直到20天后，誘導的葉狀體能長出綠色的培養(yǎng)物， 以后生長速度加快，50天左右形成葉狀體組織塊。

（5）葉狀體株系構建：當代誘導的葉狀體培養(yǎng)50天后,取半致死劑量處理的恢復生長的培養(yǎng)物建立株系，將每塊葉狀體組織塊分割后建成單個株系，并標記株系代號，以后按株系繼代擴大培養(yǎng)，每50天為繼代周期，連續(xù)培養(yǎng)5代，以高效液相色譜法檢測每個株系的石杉堿甲含量(ug/g)；

（6）重復誘導篩選高產石杉堿甲葉狀體株系：選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系，重復步驟（2）、（3），取半致死劑量為3%雙氧水浸泡13～15分鐘脅迫誘導葉狀體,經步驟（4）和（5），定向篩選高產石杉堿甲的葉狀體株系；

（7）葉狀體株系分割繼代：分別從每株系取一小部分葉狀體切割成小塊作繼代，接種到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每45～50天轉代一次，分別建成葉狀體無性繁殖株系；

（8）高產石杉堿甲葉狀體株系的建立與鑒定：每株系繼代剩余的另一大部分葉狀體培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)25～35天后收獲，用作提取檢測石杉堿甲含量，連續(xù)培養(yǎng)收獲5代，世代間石杉堿甲含量高且重復一致的株系，鑒定為高產石杉堿甲葉狀體株系。

所述繼代培養(yǎng)基按下列成份組成并進行配制：

誘導后葉狀體生長繼代培養(yǎng)基：1/4MS+蔗糖2.5%+瓊脂粉0.6%；培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高溫高壓下滅菌25min后使用。

所述培養(yǎng)條件如下：

培養(yǎng)參數(shù)：恒溫23±2℃,相對濕度60%～70%，光照強度為1500～1800lx,日照時長13～15 h/d；

葉狀體誘導半致死劑量為3%雙氧水處理13～15分鐘，篩選獲得高產株系的葉狀體生物量每代鮮重比接種量增加30～35倍、葉狀體每克干重含石杉堿甲60～88微克。