[發明專利]一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法

有效

• 申請號: 201610051268.7
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105638476B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 涂藝聲;葉麗婻;黃倩;余曉;袁慧慧;陳曼
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所36122
• 代理人: 夏材祥

1.一種誘導蛇足石杉離體葉狀體高產石杉堿甲的方法,其特征在于:

(1)所用材料：材料為離體培養建立的蛇足石杉葉狀體組織塊；該材料制備方法已申請專利,專利號ZL201210005499.6，專利名稱“產石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導和增殖的培養方法”；

(2)葉狀體組織塊分割：在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用；

(3)誘導葉狀體：將單片葉狀體置于3％雙氧水處理13～15分鐘，棄雙氧水處理液，然后用無菌水重復多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養基上培養；

(4)葉狀體株系恢復生長過程：誘導材料接種在繼代培養基上第三天至第十五天葉狀體幾乎全變白色，直到20天后，誘導的葉狀體能長出綠色的培養物，以后生長速度加快，50天形成葉狀體組織塊；

(5)葉狀體株系構建：當代誘導的葉狀體培養50天后,取半致死劑量為3％的雙氧水處理13-15分鐘的恢復生長的培養物建立株系，將每塊葉狀體組織塊分割后建成單個株系，并標記株系代號，以后按株系繼代擴大培養，每50天為繼代周期，連續培養5代，以高效液相色譜法檢測每個株系的石杉堿甲含量,單位為ug/g；

(6)重復誘導篩選高產石杉堿甲葉狀體株系：選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系，重復步驟(2)、(3)，取半致死劑量為3％雙氧水浸泡13～15分鐘脅迫誘導葉狀體,經步驟(4)和(5)，定向篩選高產石杉堿甲的葉狀體株系；

(7)葉狀體株系分割繼代：分別從每株系取一小部分葉狀體切割成小塊作繼代，接種到繼代培養基上繼代培養，以后每45～50天轉代一次，分別建成葉狀體無性繁殖株系；

(8)高產石杉堿甲葉狀體株系的建立與鑒定：每株系繼代剩余的另一大部分葉狀體培養物繼續培養25～35天后收獲，用作提取檢測石杉堿甲含量，連續培養收獲5代，世代間石杉堿甲含量高且重復一致的株系，鑒定為高產石杉堿甲葉狀體株系；

所述繼代培養基按下列成份組成并進行配制：1/4MS+蔗糖2.5％+瓊脂粉0.6％；培養基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高溫高壓下滅菌25min后使用；培養參數：恒溫23±2℃,相對濕度60％～70％，光照強度為1500～1800lx,日照時長13～15h/d。