[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)蛇足石杉離體葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610051268.7
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105638476B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 涂藝聲;葉麗婻;黃倩;余曉;袁慧慧;陳曼
• 申請（專利權(quán)）人: 江西師范大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00
• 代理公司: 南昌市平凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所36122
• 代理人: 夏材祥

1.一種誘導(dǎo)蛇足石杉離體葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲的方法,其特征在于:

(1)所用材料：材料為離體培養(yǎng)建立的蛇足石杉葉狀體組織塊；該材料制備方法已申請專利,專利號ZL201210005499.6，專利名稱“產(chǎn)石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)方法”；

(2)葉狀體組織塊分割：在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用；

(3)誘導(dǎo)葉狀體：將單片葉狀體置于3％雙氧水處理13～15分鐘，棄雙氧水處理液，然后用無菌水重復(fù)多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

(4)葉狀體株系恢復(fù)生長過程：誘導(dǎo)材料接種在繼代培養(yǎng)基上第三天至第十五天葉狀體幾乎全變白色，直到20天后，誘導(dǎo)的葉狀體能長出綠色的培養(yǎng)物，以后生長速度加快，50天形成葉狀體組織塊；

(5)葉狀體株系構(gòu)建：當(dāng)代誘導(dǎo)的葉狀體培養(yǎng)50天后,取半致死劑量為3％的雙氧水處理13-15分鐘的恢復(fù)生長的培養(yǎng)物建立株系，將每塊葉狀體組織塊分割后建成單個株系，并標(biāo)記株系代號，以后按株系繼代擴(kuò)大培養(yǎng)，每50天為繼代周期，連續(xù)培養(yǎng)5代，以高效液相色譜法檢測每個株系的石杉堿甲含量,單位為ug/g；

(6)重復(fù)誘導(dǎo)篩選高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系：選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系，重復(fù)步驟(2)、(3)，取半致死劑量為3％雙氧水浸泡13～15分鐘脅迫誘導(dǎo)葉狀體,經(jīng)步驟(4)和(5)，定向篩選高產(chǎn)石杉堿甲的葉狀體株系；

(7)葉狀體株系分割繼代：分別從每株系取一小部分葉狀體切割成小塊作繼代，接種到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每45～50天轉(zhuǎn)代一次，分別建成葉狀體無性繁殖株系；

(8)高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系的建立與鑒定：每株系繼代剩余的另一大部分葉狀體培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)25～35天后收獲，用作提取檢測石杉堿甲含量，連續(xù)培養(yǎng)收獲5代，世代間石杉堿甲含量高且重復(fù)一致的株系，鑒定為高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系；

所述繼代培養(yǎng)基按下列成份組成并進(jìn)行配制：1/4MS+蔗糖2.5％+瓊脂粉0.6％；培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高溫高壓下滅菌25min后使用；培養(yǎng)參數(shù)：恒溫23±2℃,相對濕度60％～70％，光照強(qiáng)度為1500～1800lx,日照時長13～15h/d。