[發(fā)明專利]一種改造的sgRNA及染色體標(biāo)記應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610051134.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105755040A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵世鵬;孫育杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/113
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種改在的sgRNA及及染色體標(biāo)記方面的應(yīng)用。屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

研究細(xì)胞中染色體及基因的位置信息對(duì)理解基因表達(dá)調(diào)控有著重要意義，要研究清楚基因在細(xì)胞核內(nèi)的空間位置與其功能性輸出的關(guān)系，需對(duì)細(xì)胞內(nèi)特異的基因位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記以獲得空間信息。同時(shí)還要獲得基因表達(dá)過(guò)程中的基因位置的動(dòng)態(tài)信息，所以發(fā)展活細(xì)胞染色質(zhì)DNA的熒光標(biāo)記技術(shù)和方法對(duì)解決基因組結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系非常重要。近幾十年熒光顯微鏡技術(shù)的發(fā)展使得在單細(xì)胞水平研究基因位點(diǎn)動(dòng)態(tài)，染色體的大區(qū)段粗略結(jié)構(gòu)，染色體的小位點(diǎn)精細(xì)結(jié)構(gòu)成為比較常規(guī)的手段。

常見(jiàn)的傳統(tǒng)標(biāo)記方法包括：熒光原位雜交(FISH)，熒光核苷酸類似物，標(biāo)記常見(jiàn)DNA結(jié)合蛋白，熒光阻遏蛋白操縱子系統(tǒng)(FROS)，可編輯人工核酸酶標(biāo)記系統(tǒng)等。

最為傳統(tǒng)的直接DNA標(biāo)記方法是在固定細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)。DNA-FISH依賴于特異的熒光標(biāo)記的短核酸探針與特定DNA片段的互補(bǔ)配對(duì)，達(dá)到將熒光基團(tuán)帶到特異DNA位點(diǎn)進(jìn)行富集放大信號(hào)的目的。此種方法依賴于核苷酸堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)，特異性好，且可以對(duì)任意的DNA序列進(jìn)行標(biāo)記，可擴(kuò)展性好，精度較高，但由于需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定并加熱使雙鏈DNA變性解鏈，對(duì)活細(xì)胞不兼容，所以無(wú)法對(duì)基因位置的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行觀察和追蹤。

直接標(biāo)記DNA本身要比標(biāo)記DNA結(jié)合蛋白更加困難。一般可以通過(guò)常見(jiàn)DNA的結(jié)合染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，如可以嵌入DNA大溝或者小溝的DAPI，Hoechst，SYBRGreen，TOTO-1，YOYO-1，SYTO等。這些染料一般較暗，無(wú)序列特異性，光轉(zhuǎn)化性質(zhì)不好，無(wú)法做超分辨成像，難追蹤動(dòng)態(tài)過(guò)程等限制了廣泛應(yīng)用。另一個(gè)較好的方法是使用特殊的核苷酸類似物，如Edu，EdC，BrdU等。這些小分子核苷酸類似物可以和正常的核苷酸一樣，在DNA復(fù)制過(guò)程中摻入DNA，然后通過(guò)免疫熒光或者光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將熒光染料加載到核苷酸類似物上實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)制過(guò)程中的染色質(zhì)的標(biāo)記。此種標(biāo)記方法無(wú)序列特異性，且需要固定細(xì)胞，對(duì)活細(xì)胞不兼容，無(wú)法獲得動(dòng)態(tài)信息。

為了標(biāo)記染色質(zhì)，可以通過(guò)標(biāo)記染色質(zhì)的結(jié)合蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞染色質(zhì)動(dòng)態(tài)成像。可以通過(guò)熒光蛋白連接的組蛋白非特異性的將所有的染色質(zhì)全部標(biāo)記，也可以標(biāo)記特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，如TRF標(biāo)記端粒，CenpA標(biāo)記著絲粒。限制是熒光蛋白-組蛋白標(biāo)記主要是通過(guò)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)外源的蛋白實(shí)現(xiàn)的，不可避免會(huì)引入人為的假象，例如影響基因組核小體的密度故改變?cè)紶顟B(tài)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，過(guò)量的外源蛋白游離不結(jié)合染色質(zhì)并導(dǎo)致錯(cuò)誤定位，染色質(zhì)被有熒光蛋白標(biāo)記外源和無(wú)熒光蛋白標(biāo)記內(nèi)源組蛋白共同占據(jù)導(dǎo)致成像低采樣頻率。此技術(shù)最大的缺點(diǎn)是應(yīng)用范圍有限，不能對(duì)任意DNA序列的實(shí)現(xiàn)自由標(biāo)記。

FROS主要是通過(guò)是在目的片段處人工插入一段外源正交的重復(fù)序列利用識(shí)別插入序列的蛋白融合熒光蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)插入位置染色質(zhì)片段的特異性熒光標(biāo)記。最為常用的FROS正交系統(tǒng)是來(lái)自大腸桿菌乳糖操縱子的LacO、大腸桿菌四環(huán)素轉(zhuǎn)座子TetO、λ噬菌體阻遏子。FROS一般都是用多重重復(fù)序列使得染色體插入位點(diǎn)局部區(qū)域上結(jié)合上百個(gè)熒光蛋白，使熒光信號(hào)得到放大，形成遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于背景熒光的亮點(diǎn)，極高的信噪比對(duì)于目的片段的精確定位和長(zhǎng)時(shí)間追蹤都非常有效。

雖然這種方法可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)DNA的動(dòng)態(tài)觀察，但其有明顯的不足。其一，通量低操作繁瑣，建成穩(wěn)定細(xì)胞系耗時(shí)長(zhǎng)。FROS系統(tǒng)在細(xì)菌和酵母中得到了非常廣泛的應(yīng)用，主要得益于細(xì)菌和酵母的遺傳學(xué)操作工具成熟，可以快速高通量構(gòu)建菌株。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)幾乎都是通過(guò)隨機(jī)整合實(shí)現(xiàn)重復(fù)序列的插入，幾乎不能控制位置及重復(fù)次數(shù)，少數(shù)通過(guò)胚胎干細(xì)胞打靶實(shí)現(xiàn)，但操作周期較長(zhǎng)，不適合高通量完成。其二，引入的較大外源序列(～10kb)對(duì)目的片段及其周圍的染色質(zhì)構(gòu)象改變也可能比較顯著。尚不清楚這種高度重復(fù)的外源序列是否會(huì)形成現(xiàn)在仍無(wú)法檢測(cè)的高級(jí)結(jié)構(gòu)干擾附近染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，故用這種方法所研究的DNA斷點(diǎn)修復(fù)動(dòng)力學(xué)過(guò)程有可能與體內(nèi)內(nèi)源性的修復(fù)過(guò)程有所不同。用這種方法追蹤不同位點(diǎn)染色體的運(yùn)動(dòng)得到的運(yùn)動(dòng)方式和擴(kuò)散系數(shù)可能與內(nèi)源真實(shí)情況存在偏差。綜上所述，F(xiàn)ROS系統(tǒng)也不適于廣泛應(yīng)用在基因組特異位點(diǎn)的活體標(biāo)記。