[發明專利]一種快速將水稻轉化為香稻的方法

有效

• 申請號: 201610050032.1
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105543228A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 王堅
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/82;C12N15/53;A01H5/00
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

1.與水稻香味代謝過程中相關基因序列中NGG特異性結合的crRNA的21-23bp的gRNA核 苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的與水稻香味代謝過程中相關基因序列中NGG特異性結合的 crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13任一所示。

3.根據敲出Badh2基因的靶點設計gRNA靶點的相關基因的序列轉化到水稻中相關質 粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14至18任一所示。

4.T7-gRNA-FPg引物，其序列如：

TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中， NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。

5.一種帶有Badh2基因敲出后的基因序列的香稻的制備方法，其特征在于：

利用CRISPR/Cas技術，選擇與代謝香味相關的基因Badh2，在其序列中找到可以剪輯的 NGG目標靶點，根據目標靶點周邊的基因序列，設計基因打靶gRNA組裝序列，構建gRNA靶點 質粒，通過農桿菌轉化法或其它轉化法將目標基因轉到水稻基因組中；對基因Badh2目標靶 點進行精確的剪輯，將基因Badh2沉默，從而積累2AP使稻米產生香味，而不影響其它的基 因和功能；再通過自交或雜交將遺傳轉化到水稻基因組中的基因片段與被剪輯的基因分 離，快速得到純合可以穩定遺傳的香稻。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟：

（1）在Badh2基因中找到具有NGG特異性結合crRNA的21-23bp的核苷酸序列，即gRNA靶 點位置；

（2）根據步驟（1）中的特異性的核苷酸序列進行gRNA靶位設計，再利用體外酶切活性檢 測SSTgRNA靶點效率；

（3）根據步驟（2）中體外切割活性檢測結果，選擇酶切效率高的靶點，構建gRNA質粒；

（4）將構建的gRNA質粒通過農桿菌轉化法或其它轉化法轉到水稻的基因組中；

（5）Cas9核酸酶在gRNA的引導下定向切割該基因序列,造成DNA的雙鏈斷裂，利用DSB 的修復機制,實現基因的定點敲除；

（6）Badh2基因被定點敲出后的植株通過自交或受體親本雜交將轉基因的片段與敲出 的基因分離得到遺傳穩定的香稻。

7.根據權利要求5或6所述的的制備方法，其特征在于：與水稻香味代謝過程中相關基 因序列中NGG特異性結合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13 任一所示。

8.根據權利要求5或6所述的的制備方法，其特征在于：根據敲出Badh2基因的靶點設計 gRNA靶點的相關基因的序列轉化到水稻中相關質粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14 至18任一所示。

9.根據權利要求5或6所述的的制備方法，其特征在于：T7-gRNA-FPg引物，其序列如：

TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中， NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。

10.一種對香味代謝過程中相關基因序列剪輯后的基因，其特征在于：在NGG特異附近 基因缺失幾個堿基，使此基因沉默。