[發明專利]一種快速將水稻轉化為香稻的方法

有效

• 申請號: 201610050032.1
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105543228A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 王堅
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/82;C12N15/53;A01H5/00
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及通過基因工程技術培育香稻植株的方 法。

背景技術

水稻是世界最重要的糧食作物之一，世界多數人口都以水稻作為主食。隨著人們 生活水平的提高以及健康意識的不斷增強，營養豐富、品質優良的功能型稻米越來越受到 人們的青睞。

香稻以其氣味芳香而得名,香稻的香味可存在于水稻植株除根部外的莖、葉、花、 稻米中。香米不僅在蒸煮后溢出芳香撲鼻的香氣,而且營養品質優良,富含各種氨基酸和蛋 白質,在國際市場上優質香米的售價是普通稻米的2～3倍,在國際稻米貿易中占有重要的 地位

研究表明，香稻含有多種揮發性化合物，而直接與水稻香味相關的揮發性物質為 2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)。由于甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2功能的缺 失會導致2AP前體物質的增加，從而積累2AP使稻米產生香味。自Bradbury等首先發現水稻 第8染色體Badh2基因第7外顯子8bp缺失及3bp突變產生無功能蛋白導致水稻香味以來，該 基因序列已經有13處位點的變異被相繼報道。因此只要對甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2缺失 或突變就可以提高水稻的香味。

CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats) 是最新出現的一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。CRISPR/Cas是細 菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。在這一系統中， crRNA(CRISPR-derivedRNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activatingRNA)結合形成 雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點切斷雙鏈 DNA。在基因組編輯過程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條RNA(sgRNA)表達同樣可以起 到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的優點是操作簡單，對基因組的效率高。需要對某一個靶 位點編輯的時候，只需要表達相應的sgRNA即可，不需要對Cas9核酸酶進行改造。它可對任 何物種的基因組進行高效率的定向編輯。

常規選育香稻是通過與香稻雜交或回交選育，周期長還將不利基因帶入，利用 CRISPR/Cas9技術，選擇Badh2基因的目標靶位點，構建gRNA靶點質粒，并導入到目標水稻的 基因組中對目標靶點剪輯，將Badh2基因沉默，積累2AP使稻米產生香味。再通過自交或雜交 將遺傳轉化的元件與剪輯后的基因分離得到純合的可以穩定遺傳的香稻。

發明內容

利用CRISPR/Cas技術，根據水稻香味代謝過程中相關基因序列，篩選出該基因靶 點位置，以靶點基因序列為基礎構建gRNA靶點質粒，并導入到目標水稻的基因組中對目標 靶點剪輯將其沉默，使香味相關物質不能代謝或分解，造成香味物質大量積累，使稻米產生 香味，再通過自交或雜交將遺傳轉化的元件與剪輯的基因分離，在不影響水稻的其它基因 結構和性狀，快速得到純合的可以穩定遺傳的香稻。其中，本發明所述基因的概念是指包括 基因的5’端非編碼區、外顯子、內含子和3’端非編碼區。

首先，香味代謝相關基因可以選擇對香味有重要作用的基因，只要其表達下調或 缺失即能導致香味物質的積累，增加稻谷的香味。本發明中，優選甜菜堿醛脫氫酶基因 Badh2，其功能的缺失會導致與水稻香味相關的揮發性物質為2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl- 1-pyrroline,2AP)前體物質的增加，從而積累2AP使稻米產生香味。

因此利用CRISPR/Cas技術，選擇與代謝香味相關的基因Badh2，在其序列中找到可 以剪輯的NGG目標靶點，根據目標靶點周邊的基因序列，設計基因打靶gRNA組裝序列，構建 gRNA靶點質粒，通過農桿菌轉化法將目標基因轉到水稻基因組中。對基因Badh2目標靶點進 行精確的剪輯，將基因Badh2沉默，從而積累2AP使稻米產生香味，而不影響其它的基因和功 能。再通過自交或雜交將遺傳轉化到水稻基因組中的基因片段與被剪輯的基因分離，在不 影響水稻的其它的基因和功能，快速得到純合可以穩定遺傳的香稻。

下面對本發明的具體內容進行描述。

本發明提供一種與水稻香味代謝過程中相關基因序列中NGG特異性結合的crRNA 的21-23bp的gRNA核苷酸序列。