[發(fā)明專利]一種硝酸還原酶測(cè)定試劑盒與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610048426.3
• 申請(qǐng)日: 2016-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105543330A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁偉;程茁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/26
• 分類號(hào): C12Q1/26
• 代理公司: 北京國(guó)智京通知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制劑領(lǐng)域，特別是一種硝酸還原酶測(cè)定試劑盒與應(yīng)用。

背景技術(shù)

硝酸還原酶是植物體內(nèi)硝態(tài)氮代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶，且硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，即在硝態(tài)氮(NO₃^-) 存在條件下能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生酶活性。植物從土壤中吸收的硝態(tài)氮首先需要經(jīng)過(guò)硝酸還原酶的催化而形成亞硝 態(tài)氮，亞硝態(tài)氮再經(jīng)過(guò)亞硝酸還原酶作用下轉(zhuǎn)化為NH₄⁺,然后NH₄⁺在谷胺酰胺合成酶作用下形成氨基酸，進(jìn) 而完成蛋白質(zhì)的合成。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，如果硝態(tài)氮代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶硝酸還原酶活性受到外界 環(huán)境的影響則植物體內(nèi)氨基酸和蛋白質(zhì)的合成就會(huì)受到阻礙，從而造成對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的嚴(yán)重不利影響。 因此，對(duì)植物體內(nèi)硝酸還原酶活性的測(cè)定，能正確反應(yīng)出植物對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收與代謝能力，是正確評(píng)價(jià) 外界環(huán)境對(duì)植物氮代謝影響的一種有效方法。目前已有的關(guān)于硝酸還原酶活性的測(cè)定方法可以歸納為兩 種：

一、活體法：

這種方法是在反應(yīng)液中加入硝態(tài)氮(NO₃^-)，通過(guò)測(cè)定硝態(tài)氮(NO₃^-)被植物體內(nèi)硝酸還原酶還原成亞 硝態(tài)氮的量來(lái)反應(yīng)酶活性的高低。但由于硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，其活性會(huì)受到反應(yīng)液中加入硝態(tài)氮 (NO₃^-)的誘導(dǎo)而提高，因此這種“活體法”測(cè)定硝酸還原酶的活性不能真實(shí)反應(yīng)植物體內(nèi)硝酸還原酶活 性，只是作為一種相對(duì)比較而加以應(yīng)用。

二、離體法：

這是一種目前正在應(yīng)用的測(cè)定植物體內(nèi)硝酸還原酶活性真實(shí)值的方法。“離體法”測(cè)定植物體內(nèi)硝酸 還原酶活性真實(shí)值方法具體步驟是：

1、反應(yīng)液配制：

(1)利用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀配制0.1mol/LpH7.5的磷酸緩沖液；

(2)配制0.1mol/LKNO₃磷酸緩沖液；

(3)配制NADH₂溶液：稱取2.0mgNADH₂溶于1ml0.1mol/L的磷酸緩沖液中；

(4)配制提取緩沖液：25mmol/L的磷酸緩沖液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/LEDTA-Na₂混合液。

2、測(cè)定方法流程：取實(shí)驗(yàn)材料洗凈剪碎，放在研缽中置低溫冰箱冷凍30min。取出在冰浴中加少量石英砂 和提取緩沖液。研磨為勻漿，低溫離心5min(4000r/min)。上清液即為粗酶提取液。上述操作盡量在冰浴 中進(jìn)行；

3、比色：取粗酶提取液，加入KNO₃磷酸緩沖液和NADH₂溶液。在30℃下保溫30min。保溫后立即加1mL 對(duì)-氨基苯磺酸溶液終止反應(yīng)，加1mLα-萘胺溶液，顯色20min，在臺(tái)式離心機(jī)上離心10min，取上清液在 分光光度計(jì)上測(cè)波長(zhǎng)540nm處的光密度值。

離體法具有的缺點(diǎn)是：(1)需要配制的反應(yīng)液多(共4種)，所需化學(xué)藥品多，價(jià)格貴；(2)測(cè)定方法流 程復(fù)雜、人為造成誤差增大。首先需要低溫冰凍研缽研磨和低溫離心，費(fèi)工、費(fèi)時(shí)。從研缽中轉(zhuǎn)移至離心 管離心時(shí)會(huì)造成研磨液的損失造成誤差；(3)比色時(shí)仍需要進(jìn)一步低溫離心，使測(cè)定時(shí)間加長(zhǎng)，造成人為 誤差加大；(4)方法復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)快速、多組測(cè)定植物體內(nèi)硝酸還原酶的真實(shí)活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種硝酸還原酶測(cè)定試劑盒與應(yīng)用，建立一種能夠簡(jiǎn)便、快速測(cè)定植物體內(nèi)硝 酸還原酶真實(shí)活性的方法在植物氮代謝研究領(lǐng)域具有重要作用。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開(kāi)了一種硝酸還原酶測(cè)定試劑盒，試劑盒包括了 以下液體：

A液：用1％(V/V)的1-丙醇1L作溶劑溶解31.2gNaH₂PO₄配制0.2MNaH₂PO₄溶液；

B液：用1％(V/V)的1-丙醇1L作溶劑溶解71.6gNa₂HPO₄配成0.2MNa₂HPO₄溶液；

C液：1％(W/V)的對(duì)-氨基苯磺酸溶液；