[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)藤壺幼蟲(chóng)早期附著程度的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610047648.3
• 申請(qǐng)日: 2016-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105506144A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高珊;孫源;張治洲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及在主要的海洋污損真核生物中對(duì)污損早期藤壺幼蟲(chóng) 附著的測(cè)定。

背景技術(shù)

海洋污損生物又稱(chēng)海洋附著生物，是生長(zhǎng)在船底、下水管道、石油平臺(tái)、漁業(yè)的網(wǎng)具及 一切海中人為設(shè)施表面的有害生物。其中藤壺是最主要的海洋污損之一，藤壺(Barnacle) 又稱(chēng)為“馬牙”或“蚵沏仔”，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、圍胸 目(Thoracica)、蔓足類(lèi)動(dòng)物，目前發(fā)現(xiàn)的藤壺共有8科約541種，其中我國(guó)約有110種。

藤壺以其特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史和種群生態(tài)成為最主要的海洋污損之一，主要生活在 潮間帶及朝下帶，附著棲息在海水中固定或浮動(dòng)的硬物上，若附著在網(wǎng)箱上，不僅堵塞網(wǎng)箱 網(wǎng)衣，易造成養(yǎng)殖的環(huán)境變差，而且增大網(wǎng)箱衣阻力，易發(fā)生大潮汛期魚(yú)體擦傷；若附著在 船底，增加船舶阻力，使航速降低；若附著在浮標(biāo)上，能降低浮力。而目前有效果的防污涂 料會(huì)對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成一定得影響，因此，針對(duì)藤壺可以試從它生長(zhǎng)發(fā)育階段的幼蟲(chóng)附著 期進(jìn)行有目標(biāo)的防除。而想要在藤壺早期附著時(shí)進(jìn)行測(cè)試其附著率，分子標(biāo)記方法成為首選 的技術(shù)手段，避開(kāi)生物形態(tài)結(jié)構(gòu)差異的干擾,直接通過(guò)檢測(cè)生物體內(nèi)大分子包含的穩(wěn)定遺傳 信息,定量描述、分析附著情況，提高了早期鑒定主要海洋污損生物物種的準(zhǔn)確度和效率。

藤壺的附著測(cè)定至少在如下幾個(gè)方面非常重要：(1)快速比較一批防污涂層在海洋污損 早期(肉眼可見(jiàn)藤壺生長(zhǎng)之前)抑制藤壺幼蟲(chóng)附著能力的差異；(2)比較某個(gè)涂層在室內(nèi)藤 壺純培養(yǎng)體系中幼蟲(chóng)附著率與實(shí)際海水中幼蟲(chóng)附著率的差異。(3)優(yōu)質(zhì)涂層抑制海洋污損的 機(jī)制研究：有時(shí)需要測(cè)定在某個(gè)特定的涂層表面藤壺的附著生長(zhǎng)被抑制是由于幼蟲(chóng)附著被抑 制還是附著后生長(zhǎng)被抑制。

中國(guó)專(zhuān)利(CN101654704A)報(bào)道了一組引物用來(lái)區(qū)分不同藤壺的亞種分類(lèi)，可以區(qū)分白 脊藤壺和紋藤壺。本專(zhuān)利涉及的引物可以用來(lái)測(cè)定更多藤壺亞種的幼蟲(chóng)附著。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種在海洋污損中對(duì)污損早期藤壺幼蟲(chóng)附著的測(cè)定。測(cè)定的特異 性是由藤壺特異性引物來(lái)保障的。該特異性引物時(shí)基于藤壺的18SrDNA設(shè)計(jì)的，其序列為 AmpR1：5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTCGTTG-3’。它與核糖體基因18SrDNA的通用引物F566 (5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’)一起使用可以確保藤壺基因擴(kuò)增的特異性。 擴(kuò)增結(jié)果可以通過(guò)qPCR或一般PCR結(jié)束后的凝膠掃描來(lái)實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種基于分子標(biāo)記技術(shù)，在主要海洋污損真核生物中檢測(cè)藤壺幼蟲(chóng)附著程度的方法，該 方法包括以下步驟：

⑴藤壺特異性引物的設(shè)計(jì)；

⑵污損早期(肉眼可見(jiàn)附著藤壺之前)海水污損樣本的采集和基因組提取；

⑶利用藤壺特異性引物對(duì)上述基因組樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)測(cè)定藤壺幼蟲(chóng)的附著。

而且，藤壺特異性引物設(shè)計(jì)方法如下：比較主要海洋污損真核生物的18S核糖體基因序 列，找出來(lái)藤壺的特異性SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)。該位點(diǎn)作為引物的3’最末端位置 使用。引物的3’倒數(shù)第二位的堿基設(shè)計(jì)原則是，它與靶序列之間沒(méi)有錯(cuò)配或形成一個(gè)錯(cuò)配 (弱錯(cuò)配：A-C,T-G；或者是中等強(qiáng)度的錯(cuò)配：A-A，C-C，G-G)，與非靶序列也形成一個(gè)錯(cuò) 配(強(qiáng)錯(cuò)配：T-T，T-C,A-G；或者是中等強(qiáng)度的錯(cuò)配：A-A，C-C，G-G)。這樣一來(lái)，引物 與靶序列完全配對(duì)或只有一個(gè)3’倒數(shù)第二位的錯(cuò)配，一般不影響擴(kuò)增效果，而與非靶序列 有兩個(gè)3’最末端的連續(xù)兩個(gè)錯(cuò)配，一般導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。如此可以獲得藤壺特異性引物。

而且，上述方法設(shè)計(jì)的藤壺特異性引物之一為AmpR1：5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTC GTTG-3’。該引物與通用引物F566：5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’一起使用可 以完成早期污損樣品中藤壺幼蟲(chóng)存在與否的測(cè)定判斷。

⑴引物設(shè)計(jì)