[發明專利]檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201610045714.3
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105624293A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 何勝祥;管俊杰;劉代新;李昂
• 申請（專利權）人: 上海同科生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 杜蔚瓊

1.一種檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括：

檢測基因HLA-B*5801的兩個正向引物、兩個反向引物及三個檢測探針的檢測引物探針 組合，包括檢測內參基因的一個正向引物、一個反向引物及一個內控探針的內控引物探針。

2.如權利要求1所述的檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于：

其中，檢測基因HLA-B*5801的第一正向引物F1為：HLA-B*5801F1：5’- GGCGGGTCTCAGCCCCTCCTCG-3’，

第一反向引物R1為：HLA-B*5801R1：5’-CCCACTGCCCCTGGTACCCGCGC-3’。

3.如權利要求1所述的檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于：

其中，檢測引物探針包括：第一檢測探針：5’-FAM-ACACGGAACATGAAGGCCTCCGC-BHQ2- 3’。

4.如權利要求1所述的檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于：

檢測引物探針包括：第二檢測探針：5’-JOE-TCGGGCCCCAGGTCGCAGCCATA-BHQ2-3’。

5.如權利要求1所述的檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于：

檢測引物探針包括：第三檢測探針：5’-CY5-CTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGT-BHQ2-3’。

6.如權利要求1所述的檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于：

其中，檢測基因HLA-B*5801的第二正向引物F2為：5’-TTCTGACTCTTCCCATCAGACC-3’，

第二反向引物R2為：5’-CCCTCCTTACCCCATCTCAGG-3’。

7.如權利要求1所述的檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，其特征在于：

其中，檢測內參基因的正向引物為：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’；

檢測內參基因的反向引物為：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’；

檢測內參基因的檢測探針為：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’。

8.一種檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步：準備待檢測DNA

第二步：PCR反應體系配制

在熒光PCR專用管內按照下列配方配制PCR反應體系：

PCR反應液，25μl；基因組DNA，約100ng；ddH2O，加至50μl；

第三步：上機檢測

按照下列步驟設置溫度循環及信號采集程序：

溫度為95℃，時間為3分鐘；再次依照以下程序運行40個循環，變性：溫度為95℃，時間 為15秒，退火：溫度為60℃，時間為20秒，延伸：溫度為72℃，時間為30秒。

第四步：分析結果

在第三步中所述的PCR反應體系及溫度循環條件下，在內控信號形成正常對數擴增“S” 型曲線的前提下，觀察反應體系內特異性檢測熒光信號是否都形成對數擴增“S”型曲線，若 都形成“S”型曲線則該待檢DNA樣本為HLA-B*5801等位基因的陽性。

9.如權利要求8所述的多色熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：

其中，所述PCR反應液包含PCR反應的緩沖液、鎂離子、dNTP、核酸聚合酶，以及如權利要 求2-7中所述的正向引物、反向引物和探針。

10.如權利要求8所述的多色熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：

第一步中，待檢測DNA濃度應不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之間。