[發(fā)明專利]檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610045714.3
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105624293A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何勝祥;管俊杰;劉代新;李昂
• 申請（專利權(quán)）人: 上海同科生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 杜蔚瓊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測HLA-B*5801等位基因的多色熒光PCR試劑盒，本發(fā)明還涉及 檢測HLA-B*5801等位基因的方法，屬于基因診斷領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人類白細(xì)胞抗原(Humanleukocyteantigens，HLA)是人類主要組織相容性復(fù)合 體的表達(dá)產(chǎn)物，在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的相互識別和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。 HLA分為三類：Ⅰ類分子為HLA-A、-B、-C系列抗原，廣泛表達(dá)于各組織有核細(xì)胞表面；Ⅱ類分 子為HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原，主要表達(dá)于B細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，I類和II類抗原都與器 官移植有關(guān)，其中Ⅱ類抗原更為重要；Ⅲ類分子為補(bǔ)體成分。HLA是迄今已知基因中等位基 因多態(tài)性最高的基因復(fù)合體，目前已經(jīng)證實(shí)包含超過2700多種等位基因。HLA是人類最復(fù)雜 的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，其多態(tài)性存在明顯的族群特征。近年來發(fā)現(xiàn)一些藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng) 與人類白細(xì)胞抗原基因多態(tài)性有關(guān)，如HLA-B*5801等位基因與別嘌醇所致Stevens- Johnson綜合征/中毒性表皮壞死松解癥(Stevens-Johnsonsyndrome/toxicepidermal necrolysis，SJS/TEN)相關(guān)。

別嘌醇(Allopurinol)是一種能抑制尿酸合成的藥物，在高尿酸血癥等癥的治療 領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。臨床主要用于：原發(fā)性和繼發(fā)性高尿酸血癥，尤其是尿酸生成過多而 引起的高尿酸血癥；反復(fù)發(fā)作后慢性痛風(fēng)者；痛風(fēng)石；尿酸性腎結(jié)石和(或)尿酸性腎病；有 腎功能不全的高尿酸血癥。然而該藥易引起嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)，別嘌醇藥疹因潛伏期長、病情 重、易復(fù)發(fā)和病死率高而受到重視。藥疹是最常見的別嘌醇藥物過敏反應(yīng)，大多數(shù)的藥疹表 現(xiàn)比較輕微，可以通過停藥相應(yīng)治療好轉(zhuǎn)。近5％的別嘌醇服用患者出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚及其附件 損害，主要表現(xiàn)為重癥藥疹，如：剝脫性皮炎、重癥多形紅斑型藥疹、中毒性表皮壞死松解 癥。這些嚴(yán)重的皮膚藥物不良反應(yīng)若不加以積極的干預(yù)和治療，死亡率很高，可達(dá)26％。

HLA-B*5801是HLA-B的一個(gè)基因亞型，已有大量研究證明別嘌醇相關(guān)的嚴(yán)重超敏 反應(yīng)與白細(xì)胞抗原HLA-B*5801密切相關(guān)，在服用別嘌醇后出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的患者中 100％存在，而在未出現(xiàn)不良反應(yīng)的患者中其攜帶率僅為10％；中國漢族人中HLA-B*5801陽 性者比白人高(12％vs2％)，發(fā)生超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)更大。臨床上已經(jīng)建議在使用別嘌醇前， 應(yīng)該進(jìn)行HLA-B*5801等位基因的檢測，以判斷是否屬于高危人群，從而有效降低由別嘌醇 引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)。美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)已經(jīng)正式發(fā)布了痛風(fēng)治療指南，黃嘌呤氧化酶抑制 劑別嘌醇和非布司他是首選的降尿酸的藥物。但是對于特定的人群，如所有中國漢族人、泰 國裔、韓國裔同時(shí)有3級以上CKD(慢性腎衰)，由于人類白細(xì)胞抗原(HLA-B*5801)陽性率高， 發(fā)生別嘌醇相關(guān)的嚴(yán)重過敏性藥疹危險(xiǎn)性增高，在使用別嘌醇前，應(yīng)該進(jìn)行HLA-B*5801快 速PCR檢測。并且臺(tái)灣衛(wèi)生署也建議在使用別嘌呤醇前，應(yīng)該進(jìn)行HLA-B*5801基因檢測，結(jié) 果陽性患者應(yīng)禁止使用該藥物。因此，研究一種快速、特異性高的PCR方法對HLA-B*5801等 位基因進(jìn)行檢測是非常必要的。

目前用于HLA-B*5801基因型鑒定的方法包括PCR-SBT法、PCR-SSP法、PCR-SSOP法。 具體如下：PCR-SBT法，即基于測序分析的聚合酶鏈反應(yīng)，主要包括PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物純化、 測序反應(yīng)、測序和結(jié)果分析四個(gè)主要步驟。主要不足是靈敏度不高，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果； 對試劑和儀器有特殊要求，不易普及；操作復(fù)雜，成本相對較高，速度慢、通量低。PCR-SSP 法，其原理是根據(jù)已知HLA基因片段設(shè)計(jì)特異性引物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠 電泳電泳分析，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜且容易污染。PCR-SSOP法，即序列特異性寡核苷酸探針，首 先對HLA的多態(tài)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增過程中對產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，然后針對擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)系列 寡核苷酸探針固定，最后將產(chǎn)物與探針雜交、放射自顯影。該技術(shù)靈敏度高，特異性較強(qiáng)，結(jié) 果直觀，但是由于其所使用的載體多為膜或滴定板，對于復(fù)雜的HLA等位基因來說，不具有 集成化的優(yōu)點(diǎn)，而且洗脫比較繁瑣，耗時(shí)較長，難以標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。