[發明專利]一種人可溶性ICOSL ELISA試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201610045558.0
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105586318B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 張學光;劉翠平;胡筱涵
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/28;G01N33/68;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 32200 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 曹毅

1.一對用于制備抗人可溶性ICOSL單克隆抗體的雜交瘤細胞株：

雜交瘤細胞株2B4，保藏編號為CGMCC NO .11291；

雜交瘤細胞株20B10，保藏編號為CGMCC NO:11187；

所述雜交瘤細胞株2B4用于產生檢測抗體；

所述雜交瘤細胞株20B10用于產生包被抗體。

2.一對抗人可溶性ICOSL單克隆抗體：

單克隆抗體2B4，其由根據權利要求1所述的雜交瘤細胞株2B4產生，其包括輕鏈和重鏈，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，其編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

單克隆抗體20B10，其由根據權利要求1所述的雜交瘤細胞株20B10產生，其包括輕鏈和重鏈，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，其編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

3.根據權利要求2所述的一對抗人可溶性ICOSL單克隆抗體在制備人可溶ICOSL

ELISA試劑盒中的用途，其中：

所述單克隆抗體2B4用作檢測抗體；

所述單克隆抗體20B10用作包被抗體。

4.一種人可溶性ICOSL ELISA試劑盒，其包括如下組分：

1）固相載體：酶標板，1塊；

2）包被抗體：抗人ICOSL單克隆抗體20B10，30μg/管，1管；

3）檢測抗體：抗人ICOSL單克隆抗體2B4，10μg/管，1管；

4）抗體稀釋液：0 .01M碳酸鹽緩沖液，pH9 .6，50mL/瓶，1瓶；

5）封閉液：牛血清白蛋白溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶；

6）樣品稀釋液：0 .01M磷酸鹽緩沖液，含有0 .5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶；

7）標準品蛋白：ICOSL-Ig融合蛋白，25ng/管，1管；

8）酶標二抗：鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯物，10μg/管，1管；

9）底物：3 ,3’,5 ,5’-四甲基聯苯胺，10mL/管，1管；

10）洗液：0 .01M磷酸鹽緩沖液，含有0 .2%吐溫20，100mL/瓶，1瓶；和

11）終止液：2M硫酸，5mL/管，1管。

5.根據權利要求4所述的人可溶性ICOSL ELISA試劑盒在定量檢測人體血清、血漿或組織液內sICOSL中的用途。

6.一種利用根據權利要求4所述的人可溶性ICOSL ELISA試劑盒進行人可溶性ICOSL定量檢測的方法，其包括如下步驟：

1）采用抗體稀釋液將包被抗體配制成濃度為2μg/mL的包被抗體工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶標板中，于4℃靜置，過夜；

2）棄掉酶標板中的包被抗體工作液，用洗液洗板3次，然后按照200μL/孔的用量加入封閉液，室溫封閉1小時；

3）按照下法配置標準品蛋白標準液：取7個EP管并依次編號，按照100μL/管的用量分別加入樣品稀釋液并置于EP管架上；采用樣品稀釋液將標準品蛋白配制成濃度為10ng/mL的液體，并吸取100μL加入到第1個EP管中，混勻后從第1個EP管中吸取100μL液體，并加入到第2個EP管中進行二倍稀釋，依此類推至第7個EP管；

4）棄掉酶標板中的封閉液，用洗液洗板3次，然后按照100μL/孔的用量加入標準品蛋白標準液和待測樣品，室溫反應2小時；

5）棄掉酶標板中的標準品蛋白標準液和待測樣品，用洗液洗板3次，采用抗體稀釋液將檢測抗體配制成濃度為0.5μg/mL的檢測抗體工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶標板中，室溫反應2小時；

6）棄掉酶標板中的檢測抗體工作液，用洗液洗板5~6次，采用樣品稀釋液將酶標二抗配制成濃度為0.5μg/mL的酶標二抗工作液，然后按照100μL/孔的用量加入到酶標板中，室溫反應1小時；

7）棄掉酶標板中的酶標二抗工作液，用洗液洗板8~10次，然后按照100μL/孔的用量加入底物，室溫避光反應10~15分鐘；

8）將終止液加入到酶標板中終止反應，然后應用酶標儀在450nm波長下測定酶標板中各孔的OD值，根據標準品的OD值擬合標準曲線，并將待測樣品的OD值代入方程，計算待測樣品中人sICOSL的濃度，即可完成定量檢測。