[發明專利]基于微流控技術的CTC蛋白質分型試劑盒

有效

• 申請號: 201610045465.8
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN106996976B
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 劉志明;吳詩揚;廖傳榮
• 申請（專利權）人: 益善生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

本發明涉及一種基于微流控技術的CTC蛋白質分型試劑盒，包括有：(1)針對不同CTCs標志蛋白質的捕獲抗體復合物：每種捕獲抗體復合物由與對應的標志蛋白質特異性結合的捕獲抗體和適配體通過可剪切材料連接而成，所述可剪切材料為具有2個或2個以上的限制性內切酶位點的回文結構的脫氧核糖核苷酸雙鏈；(2)表面偶聯有細胞捕獲組件的微流控芯片：該微流控芯片表面固定有由微柱構成的細胞捕獲組件，所述微柱的一端修飾有能與適配體發生結合反應的特異性結合物。本發明采用微流控技術實現了對CTCs高效、快速的自動化檢測和分型，操作簡單，減少人為操作因素造成的假陰性和假陽性結果，提高了檢測的靈敏度和準確性。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種基于微流控技術的CTC蛋白質分型試劑盒，適用于血液中循環腫瘤細胞的捕獲、分離純化和分型鑒定。

背景技術

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)來源于原發腫瘤或轉移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并通過入侵組織基質進入血管，是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱。根據其表面抗原的表達差異主要分為上皮標志物陽性表型(簡稱上皮細胞型)、間質標志物陽性表型(簡稱間質細胞型)和上皮與間質混合表型(簡稱上皮-間質細胞型)等。上皮細胞型CTCs通過發生上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增加遷移和侵襲能力，到達潛在的轉移位點，在合適的微環境下可形成新的腫瘤灶。因此，對腫瘤患者血液中的CTCs進行檢測和分型鑒定對疾病的早期診斷、療效評估、個體化治療方案的建立和預后評估具有重要意義。

CTCs在人體血細胞中的含量很少，1mL血中僅含有約1-10個CTCs，因此，對其檢測和分型鑒定技術必須要具備極高的靈敏度和特異性。目前通過表面蛋白質的表達對CTCs進行檢測主要依賴于上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)，由于處于不同的階段CTCs抗原表達具有差異，所以造成了丟失EpCAM表達的CTCs無法被檢測。且傳統的蛋白質檢測技術，如免疫熒光染色、流式細胞術和免疫染色法等具有操作過于繁瑣、樣品消耗量大以及不能自動化等缺陷，無法實現CTCs的高效、精準的自動化檢測。

微流控技術是指在可在微納米尺度范圍內集成物理、化學及生物手段，實現整體器件的微型化和低成本檢測系統，為CTCs的高靈敏度、高效分選提供重要的潛在技術方法。國內外均有商品化的基于微流控技術的CTCs檢測鑒定方法和試劑盒上市，包括CellSearch檢測系統、微流控多色熒光細胞計數儀、循環腫瘤細胞檢測系統和循環腫瘤細胞捕獲儀及其捕獲染色方法等。目前的微流控技術主要基于CTCs的物理性質(細胞大小和變形性差異等)和抗原表達差異來進行捕獲和鑒定。由于使用的捕獲抗體較單一，大多基于上皮細胞標志物，造成了一定程度的漏檢，降低了檢測的靈敏度和準確性。為了對捕獲的CTCs進行分子和蛋白質分析，需要將其與特異性結合物分離。傳統的分離方法具有回收率低、損傷細胞活性、完整性和表面抗原等缺陷，影響了后續的分型鑒定。因此，急需一種靈敏度高、精確度高、特異性強的高效自動化CTCs分型檢測方法。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種基于微流控技術的CTC蛋白質分型試劑盒，能通過從生物樣本中高效捕獲、分離和檢測CTCs蛋白質是否存在，實現對CTCs進行分型鑒定。

實現上述目的的技術方案如下。

一種基于微流控技術的CTC蛋白質分型試劑盒，包括有：

(1)針對不同CTCs標志蛋白質的捕獲抗體復合物：每種捕獲抗體復合物由與對應的標志蛋白質特異性結合的捕獲抗體和適配體通過可剪切材料連接而成，所述可剪切材料為具有2個或2個以上的限制性內切酶位點的回文結構的脫氧核糖核苷酸雙鏈；所述適配體能與相應的特異性結合物結合，