[發明專利]食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的聯合評價模型

在審

• 申請號: 201610043762.9
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105567564A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 韋燕燕;鄭小曼;呂夢婷;顧明華;黎曉峰;何冰;王學禮
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12N5/071;C12Q1/02;C12Q1/32
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 覃現凱

1.食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的聯合評價模型，其特征在于，包括腸黏膜上皮 細胞、肝細胞以及由微孔膜分隔成頂側室和基底側室的容器，腸黏膜上皮細胞培養在頂側室 中，肝細胞培養在基底側室中。

2.如權利要求1所述聯合細胞模型，其特征在于，所述頂側室為包含有微孔膜的 Transwell插入式細胞培養皿，基底側室為細胞培養板，Transwell插入式細胞培養皿安裝在細 胞培養板的培養孔中。

3.如權利要求1所述聯合細胞模型，其特征在于，所述腸黏膜上皮細胞包括Caco-2細 胞和HT29-MTX細胞，所述肝細胞為QSG7701肝細胞。

4.如權利要求1所述聯合評價模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)腸黏膜上皮細胞培養

將Caco-2細胞與HT29-MTX細胞共培養于六孔板的Transwell插入式細胞培養皿中，形 成腸黏膜上皮細胞單層，

(2)肝細胞培養

將QSG7701肝細胞培養在另一塊六孔培養板中，

(3)聯合評價模型的建立

將載有Caco-2細胞和HT29-MTX細胞的Transwell插入式細胞培養皿置于培養QSG7701 細胞的六孔板之上，即可。

5.如權利要求4所述聯合評價模型的建立方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為：

將Transwell插入式細胞培養皿放入六孔培養板中，Caco-2細胞和HT29-MTX細胞按9： 1混合得到混合細胞懸液，將1.5ml密度為1×10⁵個/ml混合細胞懸液接種于Transwell插入式 細胞培養皿中，同時，在基底側室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培養液，其中胎 牛血清的體積分數為10％；再置于37℃、5％CO₂、相對濕度90％的恒溫培養箱中連續培 養18～21天，期間每天更換基底側室中的培養液，得到載有細胞跨膜電阻值大于等于 250Ω·cm²的腸黏膜上皮細胞的Transwell插入式細胞培養皿。

6.如權利要求4所述聯合評價模型的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為：

取另一塊六孔培養板，每孔加入2ml細胞密度為1.5×10⁵個/mL的QSG7701肝細胞液， 采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培養基，其中胎牛血清的體積分數為10％，然后置于37 ℃、5％CO₂、相對濕度90％的恒溫培養箱中連續培養3～5天，期間每天更換培養液，得載 有QSG7701細胞的細胞培養板。

7.一種利用如權利要求1所述聯合評價模型評價食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的 方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)制備無菌食品待測液；

(2)將無菌食品待測液加入到所述聯合評價模型的頂側室的腸黏膜上皮細胞上，將HBSS 溶液作為轉運溶液加入到所述聯合評價模型的基底側室的肝細胞上，再將所述聯合評價模型 放入培養箱中培養；

(3)評價指標

①.分別檢測腸黏膜上皮細胞、肝細胞和轉運溶液中的鉛含量，根據檢測結果評價待測食 品中鉛對人體的生物利用率；

②.分別收集基底側室中肝細胞和轉運溶液樣品，檢測肝細胞和轉運溶液中乳酸脫氫酶活 性，根據檢測結果評價待測定食品中鉛對肝細胞的毒性。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)具體為：

取待測食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒溫水浴鍋中消化2h；然后加入pH5.0 的胰酶和膽汁消化液，在37℃恒溫水浴鍋中消化2h；用固體NaHCO₃調節消化液pH值為 7.0～7.2，離心，收取上清液，上清液經0.22μm無菌濾膜過濾，獲取無菌食品待測液。

9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述聯合細胞模型放入37℃、5％CO₂、 相對濕度90％的培養箱中培養24h。

10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(3)具體為：

①分別收集腸黏膜上皮細胞、肝細胞和轉運溶液的樣品，各個樣品分別經過體積比為的 4:1硝酸-雙氧水消解，采用電感耦合等離子體質譜技術分別檢測各個樣品中鉛含量，并通過 下式計算鉛的生物利用率：

鉛的生物利用率(％)＝(腸黏膜上皮細胞鉛含量+肝細胞鉛含量+轉運溶液鉛含量)/ 食品中鉛含量×100％

②分別收集基底側室中肝細胞和轉運溶液樣品，每孔肝細胞中加入細胞裂解液100μL， 于4℃靜置15min后離心10min，收集細胞裂解液，采用乳酸脫氫酶試劑盒分別測定細胞 裂解液和轉運溶液中的乳酸脫氫酶活性，根據乳酸脫氫酶漏出率評價待測定食品中鉛對人體 的毒性，乳酸脫氫酶漏出率的計算式如下：

乳酸脫氫酶漏出率＝轉運溶液中乳酸脫氫酶活性/(轉運溶液中乳酸脫氫酶活性+細 胞裂解液中乳酸脫氫酶活性)×100％。