[發(fā)明專利]食品中鉛對(duì)人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評(píng)價(jià)模型

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610043762.9
• 申請(qǐng)日: 2016-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN105567564A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋燕燕;鄭小曼;呂夢(mèng)婷;顧明華;黎曉峰;何冰;王學(xué)禮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12M3/00
• 分類號(hào): C12M3/00;C12N5/071;C12Q1/02;C12Q1/32
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 覃現(xiàn)凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種食品中鉛對(duì)人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評(píng)價(jià)模型。

背景技術(shù)

近年來，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及人類采礦、冶煉等活動(dòng)的加劇，大量的鉛排放到環(huán)境中， 致使農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中鉛污染。人類主要通過膳食和呼吸途徑攝入鉛，而長期攝入被鉛污染的食品 會(huì)引起人體的鉛中毒。食品安全性評(píng)價(jià)是預(yù)防人體鉛中毒的重要保障。目前大多數(shù)評(píng)價(jià)方法 基于食品中鉛的含量間接計(jì)算食品攝入鉛對(duì)人體的生物效應(yīng)，該方法并不能真實(shí)反映食品攝 入鉛的生物效應(yīng)。另外常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)耗時(shí)長、成本高、種屬差異較大，限制了其數(shù)據(jù) 在人體的外推性。因此建立相對(duì)操作方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)有效地評(píng)價(jià)食品中鉛對(duì)人體生物利用率 及毒性的方法已成為研究熱點(diǎn)。

小腸是人體攝入食品中鉛后吸收的主要部位。食品中鉛在小腸中的吸收是決定其人體生 物利用的關(guān)鍵因素。Caco-2單層細(xì)胞模型，即人結(jié)腸癌細(xì)胞模型，是目前被廣泛應(yīng)用于研究 外源物質(zhì)在人體吸收特征的代表性體外細(xì)胞模型之一。但該模型存在缺陷，尤其是缺乏分泌 黏液的功能。另外，該模型也缺乏鉛向體內(nèi)器官的轉(zhuǎn)運(yùn)和蓄積過程的評(píng)價(jià)，從而與鉛在人體 內(nèi)的吸收過程存在差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與鉛的實(shí)際生物利用率存在差異。

基于以上原因，本發(fā)明利用通過在Caco-2細(xì)胞中加入具有分泌黏液的能力的HT29-MTX 細(xì)胞，共培養(yǎng)形成腸黏膜上皮細(xì)胞層，并聯(lián)合QSG7701肝細(xì)胞建立人源性聯(lián)合細(xì)胞模型同時(shí) 評(píng)價(jià)食品中鉛對(duì)人體的生物利用率及毒性的方法。該模型接近真實(shí)的人體生理環(huán)境，能夠很 好地模擬鉛在人體的生物學(xué)行為，此評(píng)價(jià)方法可以更方便、更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)食品中鉛的生物利 用率及毒性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種人食品中鉛對(duì)人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評(píng)價(jià)模型。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

食品中鉛對(duì)人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評(píng)價(jià)模型，包括腸黏膜上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞以 及由微孔膜分隔成頂側(cè)室和基底側(cè)室的容器，腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)在頂側(cè)室中，肝細(xì)胞培養(yǎng) 在基底側(cè)室中。

所述頂側(cè)室為包含有微孔膜的Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，基底側(cè)室為細(xì)胞培養(yǎng)板， Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿安裝在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中。

所述腸黏膜上皮細(xì)胞包括Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞，所述肝細(xì)胞為QSG7701肝細(xì) 胞。

所述聯(lián)合評(píng)價(jià)模型的建立方法，包括如下步驟：

(1)腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞與HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)于六孔板的Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，形 成腸黏膜上皮細(xì)胞單層，

(2)肝細(xì)胞培養(yǎng)

將QSG7701肝細(xì)胞培養(yǎng)在另一塊六孔培養(yǎng)板中，

(3)聯(lián)合評(píng)價(jià)模型的建立

將載有Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞的Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)QSG7701 細(xì)胞的六孔板之上，即可。

所述步驟(1)具體為：

將Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入六孔培養(yǎng)板中，Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞按9： 1混合得到混合細(xì)胞懸液，將1.5ml密度為1×10⁵個(gè)/ml混合細(xì)胞懸液接種于Transwell插入式 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同時(shí)，在基底側(cè)室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液，其中胎 牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10％；再置于37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度90％的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培 養(yǎng)18～21天，期間每天更換基底側(cè)室中的培養(yǎng)液，得到載有細(xì)胞跨膜電阻值大于等于 250Ω·cm²的腸黏膜上皮細(xì)胞的Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿。

所述步驟(2)具體為：

取另一塊六孔培養(yǎng)板，每孔加入2ml細(xì)胞密度為1.5×10⁵個(gè)/mL的QSG7701肝細(xì)胞液， 采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10％，然后置于37 ℃、5％CO₂、相對(duì)濕度90％的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3～5天，期間每天更換培養(yǎng)液，得載 有QSG7701細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板。

一種利用所述聯(lián)合評(píng)價(jià)模型評(píng)價(jià)食品中鉛對(duì)人體的生物利用率及毒性的方法，包括如下 步驟：

(1)制備無菌食品待測(cè)液；