[發明專利]一種卡那霉素殘留的可視檢測方法

在審

• 申請號: 201610040365.6
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105699309A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 許媛媛;盧辰赫;孫楊楊
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明是一種基于核酸適體的卡那霉素殘留的可視化檢測方法及應用，特別是牛奶中 卡那霉素殘留的檢測方法，屬于分析化學領域。

背景技術

卡那霉素是一種有效的可用于革蘭陰性菌和革蘭陽性菌感染治療的氨基糖苷類廣譜 抗生素，是臨床上最為常用的抗感染藥物之一。由于它作用力較強并且持久，被廣泛用于人 類以及動物注射以及口服等形式的治療。然而過量使用卡那霉素或者長期食用含有卡那霉素 殘留的動物源性食品，則會導致一系列不良反應，包括耳、腎臟毒性以及過敏性休克等。因 此，建立食品源抗生素殘留的檢測方法，對實際生產生活具有重大意義。

核酸適體是通過體外篩選獲得的單鏈寡核苷酸功能配體，它能夠與特定的目標物質 高效、特異地結合。由于其成本低廉，性質穩定，已經成為抗體的有效替代品，因此，基于 核酸適體的檢測，在分析化學領域引起了相當的關注。目前，核酸適體已廣泛的應用于小分 子、蛋白質和細胞的檢測。伴隨著卡那霉素適體的發現，基于適體的卡那霉素檢測方法得到 了發展。另一方面，伴隨納米技術的發展，基于銀或金納米的比色法檢測由于其簡潔性、可 視性、易操作性、低成本和高靈敏度等獨特的優勢，得到了廣泛的利用。

現今，檢測卡那霉素常見技術主要包括有幾種方法，如酶聯免疫吸附測定法，毛細 管電泳，高效液相色譜法，表面等離子體共振，電化學方法與比色法。值得一提的是，基于 納米顆粒的比色法檢測由于其操作簡便、現象直接，引起了國內外學者相當的關注。現今基 于納米顆粒的比色法檢測，主要分為兩類，一類是基于共價修飾納米顆粒的檢測方法，此類 檢測方法檢測專一性強，但是操作過程復雜，不利于實際應用；另一類是基于物質吸附納米 顆粒的檢測方法，此類方法操作簡單，但是由于納米顆粒的穩定性極易被外界條件所影響， 因此，專一性不強，假陽性誤差大。因此，建立一種專一性強、操作簡便、假陽性誤差小， 同時，快速、簡易、靈敏的卡那霉素檢測方法顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的是將核酸適體的專一性與銀納米的可視檢測的優勢結合，建立一種專 一性強、操作簡便、假陽性誤差小，同時，快速、簡易、靈敏的，可方便應用于實際牛奶中 卡那霉素殘留的檢測方法。

本發明的技術方案：本發明是一種基于卡那適體的卡那霉素殘留的檢測方法，主要 基于卡那霉素的保護機制和核酸適體的選擇機制。保護機制是利用銀納米大的比表面積將卡 那霉素吸附于銀納米表面，加入高濃度氯化鈉，銀納米在404nm有吸收峰，證實該物質對銀 納米有保護；選擇機制是在卡那霉素與銀納米的混液中，加入與卡那霉素有高親和力的核酸 適體，使卡那霉素脫離銀納米表面，此時加入高濃度氯化鈉，銀納米在404nm處的吸收峰消 失，證實該物質即為與適體有高親和力的卡那霉素；利用404nm處紫外吸收峰的變化與卡那 霉素濃度的關系，即可實現卡那霉素的測定，亦可通過裸眼實現卡那濃度粗測，實現可視化 檢測。

方法包括以下步驟：卡那霉素的保護機制，核酸適體的選擇機制，不同濃度卡那霉 素標準曲線的繪制與牛奶中卡那霉素殘留的檢測。

(1)卡那霉素的保護機制

將25μL含有不同濃度的卡那霉素標準溶液添加到100μL銀納米溶液中于室溫孵化五 分鐘，之后加入50μL綁定溶液(10mMTris-HCl，50mMNaCl，5mMKCland5mMMgCl₂)， 于室溫孵育10分鐘，加入25μL含有2.0MNaCl溶液繼續反應30秒，測量600nm-300nm的 紫外吸收。

(2)核酸適體的選擇機制

將25μL含有不同濃度的卡那霉素標準溶液添加到100μL銀納米溶液中于室溫孵化五 分鐘，之后加入50μL含1.0μM卡那霉素核酸適體的綁定溶液(10mMTris-HCl，50mMNaCl， 5mMKCland5mMMgCl₂)于室溫孵育10分鐘，加入25μL含有2.0MNaCl溶液繼續反應 30秒，測量600nm-300nm的紫外吸收。

上述卡那霉素核酸適體的序列為：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3′。

(3)不同濃度卡那霉素溶液標準曲線的繪制