[發(fā)明專利]肺癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的篩選方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610040342.5
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105506062A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許瑞安;李文茂;高燕;吳雅清;蔡雙鳳;崔秀靈
• 申請（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 戴中生

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及基因的表達(dá)調(diào)控，具體涉及肺癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào) 控元件的篩選方法。

【背景技術(shù)】

DKK1是經(jīng)典wnt信號通路的拮抗劑，它可以與Lrp5/6受體蛋白結(jié)合，對wnt信號通 路產(chǎn)生競爭性抑制作用。在DKK1的血清濃度檢測中，與其它惡性腫瘤、良性肺疾病和健康對 照組相比，肺癌患者血清DKK1濃度明顯升高，可作為一種肺癌診斷的血清標(biāo)志物，但研究發(fā) 現(xiàn)DKK1啟動子在肺癌中的活性并不是很高。真核生物基因的空間、時間特異性表達(dá)調(diào)控是 一個極其復(fù)雜的過程，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一些DNA序列稱之為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 (Transcriptionalregulatoryelements，TREs)，主要包括啟動子、增強子、絕緣子等。啟 動子是調(diào)控基因表達(dá)的基本元件，但是針對DKK1在肺癌中的這種高水平、特異性表達(dá)特點， 我們認(rèn)為除了DKK1啟動子元件外，仍需要有其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如增強子的協(xié)同調(diào)控DKK1的 表達(dá)。因此，對DKK1基因增強子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在基因組中預(yù)測及定位至關(guān)重要。

在基因組中，TREs的預(yù)測將是一個重大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的方法是通過比較基因組學(xué)尋 找物種間同源非編碼DNA保守序列。近幾年，隨著基因芯片技術(shù)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展， 通過基因組范圍內(nèi)檢測分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與相關(guān)的表觀標(biāo)志物，可以實現(xiàn)強有力的TRE預(yù) 測分析。在染色質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件區(qū)域常缺乏核小體，這種相對開放性的構(gòu)象可以允許轉(zhuǎn) 錄調(diào)控因子與DNA序列結(jié)合，它們可以選擇性被DNase消化，而其他被核小體包圍的高度有 序的區(qū)域則不會被消化。利用DNaseI超敏位點檢測方法結(jié)合基因芯片技術(shù)(DNase-chip) 或深度測序技術(shù)(DNase-Seq)可應(yīng)用于全基因組范圍進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的篩選和鑒定。隨 著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)發(fā)展的ChIP-seq技術(shù)被廣泛 用于全基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究，該方法可以全基因組范圍定位轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合 位點。DNA片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性驗證最廣泛有效的一種方式是報告基因瞬時轉(zhuǎn)染的方法。在 這種方法中，將預(yù)測TRE置于熒光素酶報告基因質(zhì)粒中，瞬時轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中。通過熒光 素酶發(fā)光強度檢測，對TRE元件的活性進行分析，可以對篩選元件實現(xiàn)高通量分析。

除了DNA序列自身及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，還存在許多表觀修飾信息影響基因表達(dá)調(diào) 控。這些表觀調(diào)控信息主要包括：組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、核小體變形等。其中組蛋白修飾 是表觀遺傳調(diào)控最重要的內(nèi)容。在染色質(zhì)中組蛋白N末端容易受到修飾酶的甲基化、乙酰化 等共價修飾。這種組蛋白修飾往往對基因的表達(dá)具有很大影響。不同的TRE元件具有不同的 組蛋白修飾模式，且多種組蛋白形成修飾組合協(xié)同影響基因的表達(dá)。

許多TRE在某種類型細(xì)胞或發(fā)育的某個階段處于沉默狀態(tài)，在進一步的功能驗證 中無表達(dá)活性。比較基因組學(xué)、DNaseI超敏性等方法不需要相應(yīng)檢測抗體，而且檢測較靈 敏，不能對TRE進行分類，且不能預(yù)測TRE元件的活性狀態(tài)。借助ChIP-chip/seq方法可以實 現(xiàn)全基因組范圍相關(guān)修飾物進行分析，并且可以根據(jù)鑒定的組蛋白修飾情況判斷相關(guān)的 TRE類型及活性。但目前ChIP-chip/seq的分辨率較低，測序信號峰在基因組中分布范圍廣， 根據(jù)信號峰很難確定篩選序列的核心區(qū)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種肺癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的篩選方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：一種肺癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 的篩選方法，通過UCSC數(shù)據(jù)庫獲取非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中DKK1基因位點周圍27kb長區(qū)域 的表觀遺傳信息，對獲得的表觀遺傳信息進行分析預(yù)測得到12條候選增強子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 片段，接著將這12條選增強子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件片段分別插入到DKK1近端啟動子上游，成功構(gòu) 建熒光素酶重組質(zhì)粒；所得熒光素酶重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、非小細(xì) 胞肺癌H460細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞、食道癌Eca-109細(xì)胞、正常肝細(xì)胞Changliver和 人胚腎細(xì)胞HEK293，并通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢驗相關(guān)候選元件活性，篩選到 對DKK1啟動子具有較高的增強表達(dá)作用的調(diào)控元件即所述肺癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。

進一步地，所述表觀遺傳信息為DNaseI超敏性、組蛋白修飾與P300結(jié)合位點。