[發明專利]雙基因表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201610039773.X
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105543275B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 劉選明;何志敏;趙小英;閻晉東;鐘鳴;李新梅;林辰濤
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了三個雙基因植物表達載體，編號為pDT1、pDT7和pDT7G，該系列載體從pCAMBIA3301?ACTIN2::3xHA?LUC改造而來，能通過一次植物轉化簡單、可靠、快速、高效地在植物中表達兩個基因，為研究蛋白與蛋白之間的相互作用以及多蛋白復合體的關系提供了新的研究途徑，且可以通過簡單的改造應用于其他的物種。

技術領域

本發明涉及從pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC改造的三個雙基因表達植物載體-pDT1、pDT7和pDT7G。

背景技術

轉基因植株的構建是現代植物生物學非常重要的先決條件。而載體作為外源基因進入目標植物的基因組的轉運者，在轉基因植株的生成方面扮演著非常重要的角色。然而隨著研究人員對多個蛋白之間關系以及多基因共同控制植物生長發育研究的需要，尤其是多蛋白的相互作用，以前的單基因載體已經不能滿足現在的需要。所以研究人員需要一種高效的方法來轉化多基因進入植物內以獲得同時表達多個基因的轉基因植株。

目前，傳統的獲得多基因轉基因植株的方法包括共轉化，再轉化以及雜交。但是這些傳統方法的缺點是共轉化的兩個或多個基因的轉化效率是不可控的，每個基因在目標基因組的插入位置也是不一樣的，而基因分離會導致不穩定的遺傳后代。另外再轉化以及雜交都是耗時的過程。

而為了克服這些缺點，具有單個或者多個轉錄盒子的多基因載體應運而生并成功應用于多個研究，但是這些多基因表達載體的應用沒有得到廣泛的推廣應用。因為大部分的方法需要亞克隆以至于克隆所耗時間拉長；沒有標簽或者報告基因與目標基因相連，這樣就導致蛋白或者基因的鑒定比較困難；另外，某些方法如采用同尾酶構建多基因載體的方法受限于可用的酶的數量不多這個問題。所以構建多基因載體需要根據研究目的而設計。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供三個可表達雙基因的植物表達載體，該系列載體改造自pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC(該載體由中國農業科學院劉斌教授實驗室贈送，本發明人實驗室保存)，可簡單快速、可靠、高效用于雙基因的表達及其轉基因植物的構建。

本發明提供的技術方案是：三個能用于雙基因表達的植物表達載體，所述載體為pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC改造而來，編號為pDT1、pDT7和pDT7G，具體如下：一種雙基因植物表達載體，改造自pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC，其具有三個獨立的轉錄單位，其中一個是在由35S啟動子控制的bar基因轉錄單位，一個是由ACTIN2啟動子控制的標簽蛋白myc基因的轉錄單位，和一個是由UBQ10啟動子控制的標簽蛋白HA基因的轉錄單位。

所述的雙基因植物表達載體，所述載體的線性結構如圖1A所示。

上述的雙基因植物表達載體，所述載體構建過程如下：

(1)準備好骨架載體pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC和克隆目標片段所需要的載體以及DNA；

(2)設計適合in-fusion克隆的含接頭的引物；

(3)從骨架pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC克隆3xHA片段，pGARD-Myc上克隆4xmyc片段，pKYLX-CRY2-GR上克隆6xHis-cGR片段，其中6xHis已合成在引物上，PER8上克隆T_NOS；

(4)用SpeI&BamHI酶切pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC，去掉3xHA-LUC，并用In-fusion酶連接4xmyc片段至該酶切后的載體上，即為中間載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4xmyc；