[發明專利]雙基因表達載體及其應用有效
| 申請號： | 201610039773.X | 申請日： | 2016-01-21 |
| 公開（公告）號： | CN105543275B | 公開（公告）日： | 2019-07-19 |
| 發明（設計）人： | 劉選明;何志敏;趙小英;閻晉東;鐘鳴;李新梅;林辰濤 | 申請（專利權）人： | 湖南大學 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N15/66 |
| 代理公司： | 北京知本村知識產權代理事務所 11039 | 代理人： | 劉江良 |
| 地址： | 410082 *** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基因 表達 載體 及其 應用 | ||
1.一種雙基因植物表達載體，其中特征在于：其是以pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S為骨架載體進行改進，所述雙基因植物表達載體構建過程如下：
(1)準備好骨架載體pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S和克隆目標片段所需要的載體以及DNA；所述骨架載體pCAMBIA3301-ACTIIN2::3xHA-LUC-T35S是改造自pCAMBIA3300，具體改造過程簡單如下：用Sac I和Bam HI酶切pCAMBIA3300和克隆的ACTIN2啟動子序列，其中，C端加入了Spe I酶切位點，純化回收后用T4連接酶將酶切的載體和片段連接；然后使用Spe I和Bam HI將中間載體以及克隆的3xHA-LUC片段進行酶切連接；最后Bam HI和PstI將上一步的中間載體以及35S terminator片段進行酶切連接；最終獲得的載體即為：pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S；
(2)設計適合in-fusion克隆的含接頭的引物；
(3)從骨架pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S克隆3xHA片段，載體上克隆4xmyc片段，pKYLX-CRY2-GR上克隆6xHis-cGR片段，其中6xHis已合成在引物上，PER8上克隆TNOS；
(4)用SpeI&BamHI酶切pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S，去掉3xHA-LUC，并用In-fusion酶連接4xmyc片段至該酶切后的載體上，即為中間載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4xmyc-T35S；
(5)將UBQ10啟動子序列與3xHA片段通過引物設計加入的ASC I酶切位點并用T4連接酶橋連接成UBQ10::3xHA片段，所述UBQ10::3xHA片段的兩端都通過引物設計在UBQ10啟動子序列的5’加入了AvrII，在3xHA的3’加入了MfeI、Aat II、Pac I和Nco I；
(6)用Pst I酶切中間載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4xmyc，用In-fusion的方法連接UBQ10::3xHA至該酶切后的載體上，即為中間載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4x Myc-T35S-UBQ10::3xHA；
(7)用Pac I和Nco I酶切(6)中的中間載體pCABIA3301-ACTIN2::4xMyc-T35S-UBQ10::3xHA，用In-fusion酶無縫連接TNOS片段至酶切后的載體上，即為最終的載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4xMyc-T35S-UBQ10::3xHA-TNOS，稱為pDT1。
2.一種雙基因植物表達載體，其中特征在于：其是以pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S為骨架載體進行改進，所述雙基因植物表達載體構建過程如下：
(1)準備好骨架載體pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S和克隆目標片段所需要的載體以及DNA；所述骨架載體pCAMBIA3301-ACTIIN2::3xHA-LUC-T35S是改造自pCAMBIA3300，具體改造過程簡單如下：用Sac I和Bam HI酶切pCAMBIA3300和克隆的ACTIN2啟動子序列，其中，C端加入了Spe I酶切位點，純化回收后用T4連接酶將酶切的載體和片段連接；然后使用Spe I和Bam HI將中間載體以及克隆的3xHA-LUC片段進行酶切連接；最后Bam HI和PstI將上一步的中間載體以及35S terminator片段進行酶切連接；最終獲得的載體即為：pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S；
(2)設計適合in-fusion克隆的含接頭的引物；
(3)從骨架pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S克隆3xHA片段，載體上克隆4xmyc片段，pKYLX-CRY2-GR上克隆6xHis-cGR片段，PER8上克隆TNOS；
(4)用SpeI&BamHI酶切pCAMBIA3301-ACTIN2::3xHA-LUC-T35S，去掉3xHA-LUC，并用In-fusion酶連接4xmyc片段至該酶切后的載體上，即為中間載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4xmyc-T35S；
(5)將UBQ10啟動子序列與6xHis-cGR片段通過引物設計加入的ASC I酶切位點并用T4連接酶橋連接成UBQ10::6xHis-cGR片段，所述UBQ10::6xHis-cGR片段的兩端都通過引物設計在UBQ10啟動子序列的5’加入了AvrII，在3xHA和6xHis-cGR的3’加入了MfeI、AatII、PacI和Nco I；
(6)用Pst I酶切中間載體pCAMBIA3301-ACTIN2::4xmyc，用In-fusion的方法連接UBQ10::6xHis-cGR至該酶切后的載體上，即為中間載體pCABIA3301-ACTIN2::4x Myc-T35S-UBQ10::6xHis-cGR；
(7)用PacI和Nco I酶切(6)中的中間載體pCABIA3301-ACTIN2::4xMyc-T35S-UBQ10::6xHis-cGR，用In-fusion酶無縫連接TNOS片段至酶切后的載體上，即為最終的載體pCABIA3301-ACTIN2::4x Myc-T35S-UBQ10::6xHis-cGR–TNOS，稱為pDT7。
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