[發(fā)明專利]一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610039697.2
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105548058B
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發(fā)明（設計）人: 劉海波;王靜;童張法;張燁;趙弘毅
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 王素娥

技術領域

本發(fā)明屬化學分析測試技術領域，具體涉及一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法，它是一種新的檢測方法。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonase aeruginosa,PA)，屬革蘭氏陰性桿菌，在水、空氣、土壤及生命有機體的皮膚、呼吸道和腸道等中廣泛分布，據(jù)調(diào)查，該菌是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，感染后可引發(fā)皮膚病、肺炎、腸道疾病、腦膜炎和敗血癥等，嚴重時可導致死亡。研究表明，銅綠假單胞菌群體效應(quorum sensing,QS)系統(tǒng)的信號分子N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone(3OC₁₂-HSL)在調(diào)控銅綠假單胞菌絕大部分毒力因子的表達中起重要作用，而銅綠假單胞菌產(chǎn)生的各種嚴重感染與其毒力因子的釋放密切相關。當銅綠假單胞菌數(shù)目較低時，僅產(chǎn)生基礎水平的信號分子，隨著銅綠假單胞菌在局部不斷生長，信號分子可在局部環(huán)境達到一定的濃度，當其濃度達到閥值時，便激活銅綠假單胞菌中相關毒力因子的表達，增強銅綠假單胞菌的致病性，導致生命體感染。因此，開發(fā)快速和靈敏的準確檢測銅綠假單胞菌的方法對生命體的健康具有重要意義。

目前，在銅綠假單胞菌的檢測方面，需要純培養(yǎng)和生化鑒定等多個步驟，操作繁瑣、檢測周期長、靈敏度低，且不能滿足快速檢測的需求。信號分子的濃度與銅綠假單胞菌的數(shù)目相關，通過對銅綠假單胞菌中信號分子濃度的測定，可以達到監(jiān)測銅綠假單胞菌生長數(shù)量的目的。銅綠假單胞菌中信號分子具有多個金屬離子結(jié)合位點(如O、N)，根據(jù)信號分子與金屬離子的結(jié)合，從而檢測銅綠假單胞菌中信號分子的研究還未見報道。

基于上述問題，本發(fā)明致力于開發(fā)簡便、快速和靈敏的檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法。通過紫外-可見吸收光譜，利用銅離子溶液，實現(xiàn)對銅綠假單胞菌中信號分子的定量檢測。本發(fā)明不僅方法簡便,而且在靈敏度、響應時間以及生物應用等方面均有突出優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

1.一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone(3OC₁₂-HSL)的新方法，銅綠假單胞菌中信號分子與Cu²⁺配位結(jié)合后，具有如下結(jié)構(gòu)式：

2.一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法，包括下列步驟：

在DMSO與H₂O體積比例為4:1的混合溶劑中，加入初始濃度為1.0mM的CuCl₂·2H₂O，然后，依次加入不同量的初始濃度為1.0mM的銅綠假單胞菌中信號分子，使得溶液中Cu²⁺的濃度為5.0x10^-4M，銅綠假單胞菌中信號分子的濃度分別為1.0μM、2.0μM、5.0μM、10.0μM、20.0μM、50.0μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM，不加入信號分子作為對照，靜置30min體系達到平衡，用紫外-可見吸收光譜儀測試不同濃度銅綠假單胞菌信號分子條件下的紫外-可見吸收光譜，以紫外-可見吸收光譜中277nm和280nm處吸收峰強度明顯改變的方式檢測銅綠假單胞菌中信號分子；所述DMSO與H₂O混合溶劑的pH值通過滴加鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)檢測體系的pH至6.5。

上述一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法，應用于Cu²⁺的CH₃OH/H₂O溶液中銅綠假單胞菌中信號分子的檢測，以紫外-可見吸收光譜中277nm處吸收峰強度明顯改變的方式檢測銅綠假單胞菌中信號分子。

上述一種檢測銅綠假單胞菌中信號分子的方法，應用于Cu²⁺的DMF/H₂O溶液中銅綠假單胞菌中信號分子的檢測，以紫外-可見吸收光譜中280nm處吸收峰強度明顯改變的方式檢測銅綠假單胞菌中信號分子。

本發(fā)明中，上述Cu²⁺的DMSO/H₂O、CH₃OH/H₂O和DMF/H₂O溶液中能夠定量檢測銅綠假單胞菌中信號分子，該Cu²⁺的溶液本身在280nm左右處沒有紫外-可見吸收峰，當與信號分子結(jié)合后，在280nm左右處的紫外-可見吸收峰顯著增強。