[發(fā)明專利]白細胞介素-10的制備工藝及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610039583.8
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105603027A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳富超;孫萬邦;羅軍敏;張磊;劉凱山;溫瓊娜
• 申請（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/81;A61K38/20;A61P37/06
• 代理公司: 重慶強大凱創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50217
• 代理人: 黃書凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白細胞介素-10的制備工藝及應(yīng)用。

背景技術(shù)

白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10)是美國DNAX研究所的Fiorentino等發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，它由小鼠的Th2細胞株D10.G4.1產(chǎn)生，能抑制Th1細胞株細胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄。其cDNA有534bp，編碼一條由178個氨基酸組成的多肽鏈，其中氨基端的18個氨基酸為信號肽，成熟的hIL-10由160個氨基酸殘基組成，單鏈分子量為18.5kD，酸性溶液中為非共價鍵連接的同源寡二聚體形式，由于糖基化程度不同，分子量略有差別，約為37.0kD。研究發(fā)現(xiàn)，hIL-10（人白細胞介素humanIL-10）可由人體多種細胞產(chǎn)生，具有免疫刺激和免疫抑制雙向調(diào)節(jié)作用，是人體免疫系統(tǒng)的中樞免疫分子之一。

目前實驗使用的rhIL-10（重組人白細胞介素recombinanthumanIL-10，rhIL-10）是由Schering-Plough研究所提供的大腸桿菌表達的重組蛋白，商品名Tennovil，含161個氨基酸，N端多含有1個蛋氨酸，非糖基化的同源單體，單體相對分子質(zhì)量18.7kD。國內(nèi)有rhIL-10的原核和真核表達研究，因表達系統(tǒng)的不同，在產(chǎn)量和純化效率上各不相同，作為藥物開發(fā)要求純度高，產(chǎn)量高，因此進一步探討rhIL-10蛋白表達及純化制備工藝十分重要。

在移植器官的免疫應(yīng)答中，由多種細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性多肽的細胞因子作為細胞免疫和炎癥反應(yīng)間的信號傳遞物質(zhì)對機體免疫功能起著重要的作用。目前多數(shù)研究認為，Th1類細胞因子與移植排斥有關(guān)，Th2類細胞因子和耐受有關(guān)，Th1及Th2兩類細胞因子在移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起著微妙的變化，常常在免疫排斥反應(yīng)的起始階段可出現(xiàn)不同的變化。而移植物的長期存活是需要Th1及Th2應(yīng)答保持相應(yīng)的動態(tài)平衡狀態(tài)。近年來，IL-10在器官移植排斥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展中起到抑制排斥作用，將IL-10應(yīng)用抗移植排斥具有深入研究意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明意在提供一種白細胞介素-10的制備工藝，以解決rhIL-10的原核和真核表達研究中，因表達系統(tǒng)的不同，在產(chǎn)量和純化效率上各不相同，無法滿足使得作為藥物開發(fā)要求的問題。

本方案中的白細胞介素-10的制備工藝，包括由以下步驟制備：

步驟1，PCR擴增hIL-10基因：根據(jù)hIL-10基因全長和質(zhì)粒pPICZαA中的多克隆位點，用軟件PimerPremier設(shè)計引物；

上游引物：5’CGGAATTCATGGCCCACAGCTCAGCA3’，

下游引物：5’GCTCTAGACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3’；

其中斜體劃線部分為引入的EcoRI位點XbaI位點，以質(zhì)粒pORF-hIL-10為模板經(jīng)PCR擴增hIL-10，PCR反應(yīng)條件為：50μl反應(yīng)體系中，94℃，預(yù)變性10min，94℃變性45s，52℃，退火45s，72℃，延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min；

步驟2，構(gòu)建hIL-10表達載體：使用EcoRI/XbaI對純化后的hIL-10基因及質(zhì)粒pPICZaA進行雙酶切，用凝膠回收試劑盒分別回收目的片段，取1μl進行瓊脂糖凝膠電泳，并以T4連接酶連接兩種目的片段得到連接產(chǎn)物；

步驟3，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，并涂布于含25μg/μlZeocin的LB平板，重組菌落形成后，以單個菌落接種液體LB后抽提重組質(zhì)粒；

步驟4，重組質(zhì)粒鑒定：以EcoRI/XbaI對所提重組質(zhì)粒做雙酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照，同時送另一份質(zhì)粒作DNA測序，經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pPICZαA-hIL-10；

步驟5，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株重組酵母菌的篩選：以重組質(zhì)粒pPICZαA-hIL-10電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母X-33，所得產(chǎn)物涂布于含Zeocin濃度為50~1000μg/ml的YPDS平板，平板上形成的菌落即為重組酵母菌，YPDS平板篩選到的重組酵母菌保存?zhèn)溆茫?

步驟6，rhIL-10蛋白表達及鑒定試劑配制：a、rhIL-10蛋白表達試劑的準(zhǔn)備；b、rhIL-10蛋白鑒定試劑的準(zhǔn)備；