[發明專利]白細胞介素-10的制備工藝及應用

在審

• 申請號: 201610039583.8
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105603027A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 陳富超;孫萬邦;羅軍敏;張磊;劉凱山;溫瓊娜
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/81;A61K38/20;A61P37/06
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 黃書凱

1.白細胞介素-10的制備工藝，其特征在于，包括由以下步驟制備：

步驟1，PCR擴增hIL-10基因：根據hIL-10基因全長和質粒pPICZαA中的多克隆位點，用軟件PimerPremier設計引物；

上游引物：5’CGGAATTCATGGCCCACAGCTCAGCA3’，

下游引物：5’GCTCTAGACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3’；

其中斜體劃線部分為引入的EcoRI位點XbaI位點，以質粒pORF-hIL-10為模板經PCR擴增hIL-10，PCR反應條件為：50μl反應體系中，94℃，預變性10min，94℃變性45s，52℃，退火45s，72℃，延伸1min，35個循環，72℃延伸10min；

步驟2，構建hIL-10表達載體：使用EcoRI/XbaI對純化后的hIL-10基因及質粒pPICZaA進行雙酶切，用凝膠回收試劑盒分別回收目的片段，取1μl進行瓊脂糖凝膠電泳，并以T4連接酶連接兩種目的片段得到連接產物；

步驟3，轉化DH5α感受態細胞：將連接產物轉化感受態E.coliDH5α，并涂布于含25μg/μlZeocin的LB平板，重組菌落形成后，以單個菌落接種液體LB后抽提重組質粒；

步驟4，重組質粒鑒定：以EcoRI/XbaI對所提重組質粒做雙酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并經凝膠成像系統拍照，同時送另一份質粒作DNA測序，經鑒定構建正確的質粒命名為pPICZαA-hIL-10；

步驟5，電轉化畢赤酵母X-33菌株重組酵母菌的篩選：以重組質粒pPICZαA-hIL-10電轉化感受態畢赤酵母X-33，所得產物涂布于含Zeocin濃度為50~1000μg/ml的YPDS平板，平板上形成的菌落即為重組酵母菌，YPDS平板篩選到的重組酵母菌保存備用；

步驟6，rhIL-10蛋白表達及鑒定試劑配制：a、rhIL-10蛋白表達試劑的準備；b、rhIL-10蛋白鑒定試劑的準備；

步驟7，rhIL-10的誘導表達：a、挑取經步驟5篩選到的重組酵母菌，接種于2mlYPD液體培養基中，30℃，250～300r/min振蕩培養24h；

b、按1：100m1比例，取24h培養物接種于BMGY培養基中，30℃，發酵培養至OD600達到5.0；

c、取發酵培養菌液按5000r/min常溫離心5min，棄上清，收集菌體；

d、按1：4比例，加入無菌水洗滌1次，5000r/min離心5min，棄上清，收集沉淀菌體；

e、菌體以BMMY培養基重懸，轉入PH值5.5~7.5、發酵溫度26~28℃發酵培養，以終濃度為0.5%的甲醇誘導表達；

f、每12h取1ml誘導培養液，離心后分離上清和菌體，于負20℃冷凍保存，同時向剩余的誘導培養液中補加培養液和甲醇；

g、4天后停止誘導，5000r/min離心5min，收集上清和菌體；

步驟8，rhIL-10的檢測：a、染色檢測：取不同時間段培養液作SDS-PAGE和考馬斯亮藍R250染色；并經凝膠成像系統拍照；

b、ELASA法檢測：根據IL-10標準品作標準曲線，以ELISA法測定36h時段培養液中的rhIL-10濃度；

c、Bradford法檢測：以Bradford法檢測同時段培養液總蛋白濃度，發酵上清液經Bradford法檢測；

步驟9，分離、Westernblot鑒定：以步驟8中36h時段的發酵上清液作SDS-PAGE后進行Westernblot分析；

步驟10，分裝保存。

2.根據權利要求1所述的白細胞介素-10的制備工藝，其特征在于：所述步驟5中，Zeocin濃度為100μg/ml。

3.根據權利要求1所述的白細胞介素-10的制備工藝，其特征在于：所述步驟7中，發酵溫度28℃。

4.根據權利要求1所述的白細胞介素-10的制備工藝，特征在于：所述步驟7中，PH值為6.5。