[發明專利]一種提高普魯蘭酶活性的方法

有效

• 申請號: 201610039333.4
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105567723B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 焦國寶;邱立友;王景冒;王明道;孫利鵬;劉仲敏
• 申請（專利權）人: 河南仰韶生化工程有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/44
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙)41104
• 代理人: 時立新

技術領域

本申請屬于生物發酵工程技術領域，具體涉及一種提高普魯蘭酶活性的方法。

背景技術

普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)不僅能夠專一性地水解支鏈淀粉分支點中的α-1,6糖苷鍵，并且能將最小單位的支鏈分解；在將其與淀粉酶和糖化酶配合使用時，可大幅度提高液化后淀粉的水解速度和糖化率；在將其與β-淀粉酶聯合作用時，可大大提高麥芽糖得率；由于這些優良特性，因而普魯蘭酶廣泛應用于高葡萄糖漿、超高麥芽糖漿、啤酒及改性淀粉等的生產中。

盡管我國在普魯蘭酶產生菌資源篩選和分子改造及基因工程等方面的研究取得了一定的進展，但無論是從自然界篩選的菌株還是工程菌株，均存在酶活力低、酶學性質差等問題，至今尚未實現工業化生產，市場被少數大型跨國公司所壟斷，價格昂貴，難以滿足國內食品與發酵等行業的迫切需要。因而提高普魯蘭酶產量或活性是當前急需解決的技術問題之一。

就現有普魯蘭酶生產而言，通過基因工程對普魯蘭酶表達基因進行改造，然后通過生物發酵工程獲得高產普魯蘭酶是較為現實和可行的技術手段。就基因改造設計而言，現有研究一般認為，幾乎所有生物的mRNA的穩定性都影響基因的表達，尤其對原核生物，其mRNA穩定性通常遠遠低于真核基因的mRNA，半衰期僅0.5~50 min，因此，提高mRNA的穩定性，有利于提高原核生物基因的表達。在對芽孢桿菌基因序列研究的基礎上，發明人認為部分芽孢桿菌基因的5′端和3′端的部分序列對于提高mRNA的穩定性具有較為重要的影響，而現有技術中，尚未見到將這些序列用于改造普魯蘭酶的報道。

發明內容

在對芽孢桿菌mRNA序列研究的基礎上，本發明認為，通過基因工程操作在普魯蘭酶基因的5′端和3′端分別附加SD序列和3t莖環結構序列后，可以較好提高普魯蘭酶表達量和活性。

下面就本發明的技術方案簡要介紹如下。

一種提高普魯蘭酶活性的方法，在利用生物發酵工程制備普魯蘭酶時，通過基因工程操作手段在普魯蘭酶基因的5’端增加SD序列，和/或在普魯蘭酶基因的3’端增加3t莖環結構序列，重組構建新的普魯蘭酶基因序列，將該基因序列轉化表達后，可以提高普魯蘭酶活性，并獲得較高表達量；

所述SD序列，包括5個堿基，如SEQ ID.1序列中的第9至13位序列所示，即：GGAGG；

所述3t莖環結構序列，包括479個堿基，如SEQ ID.1序列中的第3339至3817位序列所示，即：

ATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACCATCTATGATAGTAAGCAAAGGATAAAAAAATGAGTTCATAAAATGAATAACATAGTGTTCTTCAACTTTCGCTTTTTGAAGGTAGATGAAGAACACTATTTTTATTTTCAAAATGAAGGAAGTTTTAAATATGTAATCATTTAAAGGGAACAATGAAAGTAGGAAATAAGTCATTATCTATAACAAAATAACATTTTTATATAGCCAGAAATGAATTATAATATTAATCTTTTCTAAATTGACGTTTTTCTAAACGTTCTATAGCTTCAAGACGCTTAGAATCATCAATATTTGTATACAGAGCTGTTGTTTCCATCGAGTTATGTCCCATTTGATTCGCTAATAGAACAAGATCTTTATTTTCGTTATAATGATTGGTTGCATAAGTATGGCGTAATTTATGAGGGCTTTTCTTTTCATCAAAAGCCCTCGTGTATTTCTCTGTAAGCT。

所述提高普魯蘭酶活性的方法，操作時具體包括以下步驟：

（1）提取菌株的DNA基因組，設計引物，并以所提取的DNA基因組為模板，進行目的基因序列的PCR擴增，對擴增產物分別回收備用；

僅在5’端增加SD序列時，引物序列可設計如下：

SD-pul-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中5’端TCTAGA表示XbaⅠ酶切位點）

SD-pul-R：GCCGACGTCAATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位點）

僅在3’端增加3t莖環結構序列時，引物序列可設計如下：

pul-3-F：GCTCTAGAGCATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中5’端TCTAGA表示XbaⅠ酶切位點）