[發明專利]一種提高普魯蘭酶活性的方法

有效

• 申請號: 201610039333.4
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105567723B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 焦國寶;邱立友;王景冒;王明道;孫利鵬;劉仲敏
• 申請（專利權）人: 河南仰韶生化工程有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/44
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙)41104
• 代理人: 時立新

1.一種提高普魯蘭酶活性的方法，其特征在于，在利用生物發酵工程制備普魯蘭酶時，通過基因工程操作手段在普魯蘭酶基因的5’端增加SD序列，和/或在普魯蘭酶基因的3’端增加3t莖環結構序列，重組構建新的普魯蘭酶基因序列，將該基因序列轉化表達；

所述SD序列，包括5個堿基，如SEQ ID.1序列中的第9至13位序列所示，即：GGAGG；

所述3t莖環結構序列，包括479個堿基，如SEQ ID.1序列中的第3339至3817位序列所示，即：

ATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACCATCTATGATAGTAAGCAAAGGATAAAAAAATGAGTTCATAAAATGAATAACATAGTGTTCTTCAACTTTCGCTTTTTGAAGGTAGATGAAGAACACTATTTTTATTTTCAAAATGAAGGAAGTTTTAAATATGTAATCATTTAAAGGGAACAATGAAAGTAGGAAATAAGTCATTATCTATAACAAAATAACATTTTTATATAGCCAGAAATGAATTATAATATTAATCTTTTCTAAATTGACGTTTTTCTAAACGTTCTATAGCTTCAAGACGCTTAGAATCATCAATATTTGTATACAGAGCTGTTGTTTCCATCGAGTTATGTCCCATTTGATTCGCTAATAGAACAAGATCTTTATTTTCGTTATAATGATTGGTTGCATAAGTATGGCGTAATTTATGAGGGCTTTTCTTTTCATCAAAAGCCCTCGTGTATTTCTCTGTAAGCT。

2.如權利要求1所述提高普魯蘭酶活性的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

（1）提取菌株的DNA基因組，設計引物，并以所提取的DNA基因組為模板，進行目的基因序列的PCR擴增，對擴增產物分別回收備用；

僅在5’端增加SD序列時，引物序列設計如下：

SD-pul-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC， SD-pul-R：GCCGACGTCAATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；

僅在3’端增加3t莖環結構序列時，引物序列設計如下：

pul-3-F：GCTCTAGAGCATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，

pul-3-R：GCCGACGTCATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；

在5’端增加SD序列的同時在3’端增加3t莖環結構序列時，設計引物序列如下：

SD-pul-3-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，

SD-pul-3-R：GCCGACGTCAGGACTAGTCCTTATTTACTGCTCACCGGCAGG；

在3’端增加3t莖環結構序列，或在5’端和3’端同時增加相應基因序列時，以3t莖環結構序列為模板，進行PCR擴增，引物序列設計如下：

3T-F：GGACTAGTCCATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACC，

3T-R：GCCGACGTCAAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC；

（2）與pMD19-T質粒載體連接，

依據欲在5’端、3’端所增加序列的不同，分別將第（1）步中所回收的PCR擴增產物與pMD19-T質粒載體進行連接；

（3）轉化、篩選，

依據欲在5’端、3’端所增加序列的不同，將第（2）步中對應構建的質粒轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，篩選陽性菌株，擴增并提取質粒；

（4）酶切、重連，

僅在5’端增加SD序列時，將第（3）步驟中所提取的對應質粒與pHT43質粒分別采用XbaⅠ、AatⅡ酶進行雙酶切，回收酶切產物，并用DNA連接酶進行連接，然后將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選、獲得重組質粒pHT43-SD-pul；

僅在3’端增加3t莖環結構序列，或在5’端和3’端同時增加基因序列時，將第（3）步驟中所提取的對應質粒與pHT43質粒分別采用XbaⅠ、AatⅡ酶進行雙酶切，回收酶切產物，并用DNA連接酶進行連接，然后將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選、獲得重組質粒pHT43-pul-3、pHT43-SD-pul-3；然后對重組質粒pHT43-pul-3、pHT43-SD-pul-3分別采用SpeⅠ和AatⅡ進行雙酶切，并回收酶切產物；同時對第（2）步驟中連接有3t莖環結構序列的pMD19-T質粒載體采用SpeⅠ和AatⅡ酶進行雙酶切，并回收酶切產物；將采用SpeⅠ和AatⅡ酶進行酶切的雙酶切產物采用DNA連接酶進行連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選、獲得重組質粒pHT43-pul-3t或pHT43-SD-pul-3t；

（5）轉化、誘導表達，

將第（4）步驟中所構建的重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，篩選陽性菌株，培養、IPTG誘導表達，表達完成后取菌液、裂解菌體、離心分離取上清，即為含有普魯蘭酶的粗酶液。