[發(fā)明專利]一種沼液中游離氨基酸的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610038817.7
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105548449A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李寧;劉文靜;李建華
• 申請（專利權(quán)）人: 同濟大學(xué)
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89;G01N30/06;G01N30/14
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及沼液的綜合開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，涉及對樣品進行前處理所需的技術(shù)，以及 所開發(fā)的適應(yīng)現(xiàn)代檢測儀器一次性分析沼液中24種游離氨基酸的檢測方法。

背景技術(shù)

目前，剩余污泥的產(chǎn)生量隨著城鎮(zhèn)污水處理能力的高速發(fā)展而迅速增加。截止至 2013年，我國剩余污泥的年產(chǎn)生量就已經(jīng)達到625萬t（以干基計）。其中的大部分并未得到 合理、安全的處理和處置。剩余污泥中富含氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，有機質(zhì)含量可達50%‐60%。 厭氧消化是一種在實現(xiàn)污泥的穩(wěn)定化同時產(chǎn)生作為能源的沼氣的技術(shù)，可以作為污泥處理 處置的合適選擇。在污泥厭氧消化過程中，除碳源以外的大部分營養(yǎng)物質(zhì)都保留在沼液和 沼渣中，尤其是氮、磷和鉀等在沼液中的含量很高。并且經(jīng)厭氧消化后，有機物大部分以簡 單的、易于被動植物吸收的小分子或離子狀態(tài)存在。這使得沼液和沼渣農(nóng)用資源化開發(fā)成 為當(dāng)前國內(nèi)外污泥處理處置技術(shù)研究的熱點之一。

在厭氧消化過程中，有機氮中一部分被轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，另一部分則參與代謝或分 解為氨基氮如游離氨基酸等的形式。氨基酸對植物生長特別是光合作用具有獨特的促進作 用，尤其是甘氨酸，它可以增加植物葉綠素含量，提高酶的活性，促進二氧化碳的滲透，使光 合作用更加旺盛，對提高作物品質(zhì)，增加維生素C和糖類的含量都有著重要作用。因此為了 解沼液中氮組分組成和存在形態(tài)以指導(dǎo)污泥綜合利用，建立快速、有效的氨基酸測試方法 顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種沼液中24種游離氨基酸的檢測方法。

本發(fā)明通過pH調(diào)節(jié)和旋蒸去除沼液氨氮和揮發(fā)性生物胺，使用Millipore新型超 濾離心管去除大分子物質(zhì)，然后聯(lián)合柱前衍生-反向-高效液相的方法對沼液游離氨基酸做 了分析，為厭氧消化過程中蛋白質(zhì)降解機理研究提供基礎(chǔ)，并且為沼液和沼渣農(nóng)用資源化 開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，采用如下技術(shù)方案：一種沼液中24種游離氨基酸的 檢測方法，包括調(diào)節(jié)沼液pH至10.2后旋蒸去掉沼液內(nèi)高濃度的氨氮和揮發(fā)性生物胺，運用 0.5ML3KMillipore超濾離心管去除大分子干擾物，運用鄰苯二甲醛（OPA）及氯甲酸9-芴 基甲酯（FMOC）兩種衍生化試劑對氨基酸進行柱前衍生化使得氨基酸具有熒光發(fā)射特征來 提高檢測靈敏度和分離選擇特性，然后運用反向-高效液相對24種氨基酸進行定性定量分 析；具體步驟如下：

（1）、儀器和試劑的選擇

所用儀器為Agilent-1260液相色譜儀，配有在線脫氣機、四元梯度泵、標(biāo)準(zhǔn)自動進樣 器、熒光檢測器(FLD)及Agilent化學(xué)工作站；17種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)：天冬氨酸、絲氨 酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈 氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸，補充氨基酸（天門冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、 正纈氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸）以及衍生化試劑鄰苯二甲醛(OPA，HPLC)、3-巰基丙酸 (3-MPA，HPLC)和氯甲酸9-芴基甲酯（FMOC，HPLC）均為Sigma(StLouis，MO，USA)產(chǎn)品。甲 醇、乙腈為HPLC級試劑；實驗用水是Milli-Q水(Millipore，USA)；其他試劑均為優(yōu)級純， 內(nèi)標(biāo)物α—氨基丁酸；

（2）、樣品的制備

（2.1）樣品的前處理

將沼液過0.22μm的濾膜去掉顆粒物，用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)過濾后的濾液pH值至10.2，取 上述沼液5ml于50ml旋蒸茄型瓶中于40℃下抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以去掉高濃度氨氮和揮 發(fā)性生物胺，用5ml0.1M鹽酸重新溶出，渦旋30s混勻，得到重新溶出液；取所述重新溶出 液200μL于0.5ML3KMliipore超濾離心管內(nèi)，13000g離心至所有液體通過，渦旋混勻置于4 ℃待用；

（2.2）樣品的衍生化處理

在0.5微升的步驟（2.1）所得樣品中混合0.5微升的OPA和0.5微升的FMOC，接著用32微 升的每100ml流動相A加400微升的磷酸的混合溶液稀釋，所得溶液用于RT-HPLC分析；混合 時間為2min，可通過安捷倫HPLC自動進樣程序自動混合，來嚴(yán)格控制各反應(yīng)時間。

（3）、RT-HPLC色譜條件

色譜柱:AgilentZorboxEclipseAAA柱(3.5μm，4.6mm×150mm)；