[發明專利]一種沼液中游離氨基酸的檢測方法

在審

• 申請號: 201610038817.7
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105548449A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 李寧;劉文靜;李建華
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89;G01N30/06;G01N30/14
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

1.一種沼液中游離氨基酸的檢測方法，其特征在于包括調節沼液pH至10.2后旋蒸去掉 沼液內高濃度的氨氮和揮發性生物胺，運用0.5ML3KMillipore超濾離心管去除大分子干 擾物，運用OPA及FMOC兩種衍生化試劑對氨基酸進行柱前衍生化使得氨基酸具有熒光發射 特征來提高檢測靈敏度和分離選擇特性，然后運用反向-高效液相對24種氨基酸進行定性 定量分析；具體步驟如下：

（1）、儀器和試劑的選擇

所用儀器為Agilent-1260液相色譜儀，配有在線脫氣機、四元梯度泵、標準自動進樣 器、熒光檢測器(FLD)及Agilent化學工作站；17種氨基酸的混合標準：天冬氨酸、絲氨 酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈 氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸，補充氨基酸（天門冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、 正纈氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸）以及衍生化試劑鄰苯二甲醛(OPA，HPLC)、3-巰基丙酸 (3-MPA，HPLC)和9-芴甲氧羰基（FMOC，HPLC）均為Sigma(StLouis，MO，USA)產品；甲醇、乙 腈為HPLC級試劑；實驗用水是Milli-Q水(Millipore，USA)；其他試劑均為優級純，內標 物α—氨基丁酸；

（2）、樣品的制備

（２.１）樣品的前處理

將沼液過0.22μm的濾膜去掉顆粒物，用1M氫氧化鈉調節過濾后的淥pH值至10.2，取上 述沼液5ml于50ml旋蒸茄型瓶中于40℃下抽真空旋轉蒸發至干，以去掉高濃度氨氮和揮發 性生物胺，用5ml0.1M鹽酸重新溶出，渦旋30s混勻，得到重新溶出液；取所述重新溶出液 200μL于0.5ML3KMliipore超濾離心管內，13000g離心至所有液體通過，渦旋混勻置于4℃ 待用；

（２.２）樣品的衍生化處理

在0.5微升的步驟（２.１）所得樣品中混合0.5微升的OPA和0.5微升的FMOC，接著用32微 升的每100ml流動相A加400微升的磷酸的混合溶液稀釋，所得溶液用于RT-HPLC分析；混合 時間為2min；，可通過安捷倫HPLC自動進樣程序自動混合，來嚴格控制各反應時間；

（3）、RT-HPLC色譜條件

色譜柱:AgilentZorboxEclipseAAA柱(3.5μm，4.6mm×150mm)；

流動相A為0.04mol/LNaH₂PO₄(10mol/LNaOH調至pH=7.8)；流動相B為超純 水∶乙腈∶甲醇為10∶45∶45(V/V/V)；

熒光檢測波長：Ex=340nm，Em=460nm，PMT=10；15.25min換波長Ex=266nm，Em =305nm,PMT=9；

流速：2ml/min；

柱溫：40℃；

流動相洗脫梯度見表1.

表1

（4）按步驟（3）所述RT-HPLC色譜條件對步驟（2）處理后的樣本上機測試，得到氨基酸分 布譜圖；采用保留時間法對樣品中氨基酸定性，即在相同的色譜分析條件下，樣品中氨基酸 的色譜峰與氨基酸標準的色譜峰保留時間相同或相近，則認為樣品中含有此氨基酸；在每 次衍生化反應之前，將內標物加入到樣品中，采用內標工作曲線法對樣品中游離氨基酸的 濃度進行定量分析。