[發(fā)明專利]尿液中修飾核苷的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610038315.4
• 申請日: 2016-01-20
• 公開（公告）號: CN105548407B
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 童鴻斌
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州漢庫醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11371
• 代理人: 李進(jìn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及液譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種尿液中修飾核苷的檢測方法。

背景技術(shù)

修飾核苷主要存在于RNA中，是在轉(zhuǎn)錄后由特定的甲基轉(zhuǎn)移酶與連接酶作用于多聚核苷分子而形式。RNA代謝都需要特定的酶來催化，正常核苷酶解后可降解或者磷脂化再利用，而修飾核苷是正常核苷的糖苷鍵、堿基、糖羥基被修飾或者兩兩結(jié)合生成的獨(dú)特性結(jié)構(gòu)，由于被高度修飾，降解修飾核苷需要的酶活性較高，特異性強(qiáng)，因此，修飾核苷從細(xì)胞中釋放出來，最終通過尿液排出。故，尿液中修飾核苷的含量可用來評價人體的核苷代謝狀況。

目前，已有報道采用毛細(xì)管電泳法對尿液中修飾核苷進(jìn)行檢測，但該方法檢測出的修飾核苷類別少。而且，由于尿液中含有多種微生物。如果長時間以液體形式保存，微生物就會污染尿液，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，現(xiàn)有的檢測方法中都是將待檢測尿液取樣后存儲于冰箱中冷凍保存，檢測時再解凍，不但需要冷凍裝置，解凍步驟也使得檢測時間變長。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種尿液中修飾核苷的檢測方法。針對檢測樣品易受微生物污染的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供的檢測方法中將尿液保存于濾紙片上，不但使其穩(wěn)定性大大提高，避免微生物的污染，而且還具有簡易、方便的優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

尿液中修飾核苷的檢測方法，包括如下步驟：

(1)尿液預(yù)處理后保存于濾紙片上，后通過萃取得到待測樣本；

(2)將所述待測樣本通過液質(zhì)聯(lián)用檢測，得到修飾核苷的種類和含量。

本發(fā)明提供的檢測方法中，通過將尿液保存于濾紙片上再通過萃取過程，運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用方法，能夠快速、有效地對尿液中的修飾核苷進(jìn)行定性和定量檢測。

由于將尿液保存于濾紙片上，將尿液樣品轉(zhuǎn)換為固體形式進(jìn)行保存，穩(wěn)定性大大提高，從而避免微生物污染檢測樣品。而且，本發(fā)明提供的方法也比現(xiàn)有的冷凍法更為簡易、方便。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述萃取的步驟具體包括：將濾紙片放入甲醇水混合溶液中經(jīng)超聲、離心后取上清液作為待測樣本。

本發(fā)明提供的檢測方法中，為了將保存在濾紙片上的尿液樣本充分還原，將濾紙片放入甲醇水混合溶液中進(jìn)行超聲，使得濾紙片上的各個組分充分溶解到溶液中，后再經(jīng)離心得到上清液，將這一上清液作為待測樣本。

在實(shí)際檢測過程中，可將保存有尿液的濾紙片打孔，孔徑為3mm，獲得直徑為3mm的濾紙圓片，取適量的濾紙圓片置于離心管中，加入甲醇水溶液后進(jìn)行超聲、離心操作。

為了保證濾紙片中的各個組分能夠充分溶解至溶液中，所用的甲醇水溶液中甲醇的體積含量為5％-50％，超聲時間為20-90min。

經(jīng)超聲后，溶液中不但含有修飾核苷，還含有其它固體雜質(zhì)，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為了將雜質(zhì)盡可能地去除，在本發(fā)明提供的檢測方法中，將離心的轉(zhuǎn)速控制在10000-18000rpm，時間為5-30min。

為了保證檢測樣本的穩(wěn)定性，步驟(1)中，所述尿液預(yù)處理后保存于濾紙片上的步驟具體包括：向尿液中加入8-溴鳥苷混合后滴于濾紙片上，并風(fēng)干3小時以上。

在上述方法中，加入的8-溴鳥苷作為內(nèi)標(biāo)物，用以對修飾核苷進(jìn)行定量分析。

優(yōu)選地，步驟(2)具體包括：

(21)稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液；

(22)稱取內(nèi)標(biāo)物，用甲醇水溶液溶解后分別加入所述標(biāo)準(zhǔn)液中，超純水定容后離心，取上清液作為待測標(biāo)準(zhǔn)液；

(23)將所述待測樣本和所述待測標(biāo)準(zhǔn)液通過液質(zhì)聯(lián)用檢測，得到修飾核苷的種類和含量。

本發(fā)明提供的檢測方法中，采用內(nèi)標(biāo)法對尿液中的修飾核苷的含量進(jìn)行檢測。在檢測過程中，稱取標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇使其完全溶解，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，向標(biāo)準(zhǔn)液中加入內(nèi)標(biāo)物后經(jīng)處理得到待測標(biāo)準(zhǔn)液，用以進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測，分別以各修飾核苷的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比對尿樣中各修飾核苷的濃度進(jìn)行線性回歸，得到各修飾核苷的線性方程，用于對尿液中各修飾核苷進(jìn)行定量分析。

為了保證液質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明采用特定的液相條件和質(zhì)譜條件，具體的，步驟(23)中，所述液質(zhì)聯(lián)用檢測的液相條件為：流動相的流速為0.1-1.0mL/min；進(jìn)樣量1-20μL；鍵合相色譜柱；柱溫20-40℃；A和B作為流動相，其中A為甲醇水溶液，B為甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序如表1所示。

表1梯度洗脫程序