[發明專利]尿液中修飾核苷的檢測方法

有效

• 申請號: 201610038315.4
• 申請日: 2016-01-20
• 公開（公告）號: CN105548407B
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 童鴻斌
• 申請（專利權）人: 杭州漢庫醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371
• 代理人: 李進

1.尿液中修飾核苷的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)尿液預處理后保存于濾紙片上，后通過萃取得到待測樣本；

(2)將所述待測樣本通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量；

步驟(1)中，所述萃取的步驟具體包括：將濾紙片放入甲醇水混合溶液中經超聲、離心后取上清液作為待測樣本；

步驟(2)具體包括：

(21)稱取標準品，用甲醇溶解，得到不同濃度的標準液；

(22)稱取內標物，用甲醇水溶液溶解后分別加入所述標準液中，超純水定容后離心，取上清液作為待測標準液；

(23)將所述待測樣本和所述待測標準液通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量；

步驟(23)中，所述液質聯用檢測的液相條件為：流速為0.1-1.0mL/min；進樣量1-20μL；鍵合相色譜柱；柱溫20-40℃；A和B作為流動相，其中A為甲醇水溶液，B為甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序為0-0.5min，A：97％、B：3％；0.5-3min，A：97～5％、B：3～95％；3-3.01min，A：5-97％、B：95-3％；3.01-11min，A：97％、B：3％；11.01min，A：97％、B：3％；13min，A：97％、B：3％；

質譜條件為：采用ESI離子源，正離子MRM掃描，霧化氣流速8-20L/min，氣簾氣流速8-20L/min，碰撞氣流速5-15L/min，離子源電壓2000-4000V，離子源溫度200-400℃；

步驟(21)中，所述標準品包括假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、1-甲基次黃嘌呤核苷、5-甲基尿苷、黃嘌呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲基鳥苷、6-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N4-乙酰基胞苷和N2,N2-二甲基鳥苷；

步驟(22)中，所述內標物為8-溴鳥苷；

所述液相條件中，流動相A為0.1-10％甲醇水溶液，B為0.1-10％甲酸甲醇溶液；

所述液相條件中，所述鍵合相色譜柱為C18或C8色譜柱，規格為(50-100)mm×(1.8-3)mm，(1.8-3)μm；

步驟(1)中，所述離心的轉速為10000-18000rpm，時間為5-20min；

步驟(1)中，所述尿液預處理后保存于濾紙片上的步驟具體包括：向尿液中加入8-溴鳥苷混合后滴于濾紙片上，并風干3小時以上；

所述修飾核苷包括假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、1-甲基次黃嘌呤核苷、5-甲基尿苷、黃嘌呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲基鳥苷、6-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N4-乙酰基胞苷和N2,N2-二甲基鳥苷。