[發明專利]一種體外牙菌斑生物膜模型及其制備方法

有效

• 申請號: 201610035271.X
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105524869B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 李淑鈺;江丹;黃亮;鐘美;張利萍
• 申請（專利權）人: 廣州立白企業集團有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/46;C12R1/04;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李德魁;張玲春

本發明公開了一種體外牙菌斑生物膜模型。在無氧氣氛下，以厭氧菌培養基作為培養介質，以口腔致病菌作為菌種，以表面親水改性處理(TC處理)的細胞培養板作為成膜介質，以培養介質對口腔致病菌培養一段時間后，在成膜介質上生長一段時間，然后進行浮游微生物的去除，最后在成膜介質的表面獲得牙菌斑生物膜。本發明具有操作簡單，穩定性高，重復性強等有益效果。

技術領域

本發明涉及一種生物膜的體外模型，屬于生物領域及口腔醫學領域，具體涉及一種體外牙菌斑生物膜模型。

背景技術

口腔里生存著多種多樣的微生物，包括細菌、真菌、病毒、支原體、原蟲等，其存在形式包括游離態和聚集態。游離態的微生物稱為浮游微生物。聚集態形式的微生物稱為生物膜。和浮游微生物相比，以生物膜存在的微生物群具有以下特點：

1)微生物之間相互積聚和定殖，具有空間和環境的多樣性；2)活性強，能夠抵御苛刻的環境而存活；3)耐受性強，對抗生素敏感性下降；4)能表達不同于浮游細菌的表型。

生物膜中微生物的生存能力、抗藥性、代謝效率均顯著高于浮游微生物；兩者呈現完全不同的生理特征。而長期以來，口腔護理產品的效能，尤其是抗菌效能，是采用浮游微生物(主要是游離的細菌)作為研究對象。其結果與真實的口腔情況存在很大的差異，難以指引口腔產品的開發和優化。

由于口腔產品的臨床實驗成本高昂，試驗周期動輒數月，而且實驗對象存在很大的特異性；導致實驗數據的準確性和重復性難以保證。增加樣本數量會導致測試成本進一步增加。因此，迫切需要建立一種體外的口腔生物膜模型；這種模型盡可能地模擬口腔的情況，而且能夠保證多次測試具有重復性。

牙菌斑生物膜是口腔環境中的主要生物膜，是導致口腔疾病如齲齒，牙齦炎，牙周炎和口源性口臭病產生的主要原因之一。牙菌斑生物膜的各種微生物粘附在牙齒表面和口腔其它軟組織上，其組成以細菌為主。細菌包括兼性厭氧菌和嚴格厭氧菌。

目前針對體外的牙菌斑生物膜的研究分為動態法和靜態法兩種。動態法是在人工唾液模擬口腔流動環境下形成牙菌斑生物膜。專利CN2628532Y、CN1480110A、CN200952006Y和CN1858200A公開了一系列用于篩選防齲藥物效能的動態生物膜模型。CN201952427U公開了一種人工口腔模擬動態牙菌斑生物膜裝置，該模型包括培養基罐，多通道泵，流動室，藥物樣品溶液瓶，廢液收集罐等組成，所述的菌種培養是以人的唾液或菌斑作為生物膜的菌種來源。

動態模型存在以下問題：

1)每個檢測周期可檢樣品數少，目前文獻報道的檢測周期一般是5至7天，每次最大可檢樣品數低于5個；

2)測試結果的重復性難以保證，目前文獻報道的結果均采用單次的數據；

3)設備非常復雜，一般必須包含發酵、培養、尾氣/廢液處理、溫控設備幾個模塊，需要大量的連接管道保持氣體環境和培養環境；

4)設備成本高昂，厭氧發酵罐一臺成本動輒在二十萬以上；

5)研究處于初期階段；目前沒有市售的整套儀器，而不同文獻中的設備多為自行構建，難以形成統一的標準，數據難以建立關聯。

靜態法是以特定菌種經歷培養后，在成膜介質上形成生物膜。典型的模型如Zurich模型，具體如文獻Guggenheim B,et al,Validation of an in vitro BiofilmModel of Supragingival Plaque.J DentRes.2001；80(1):363-370。靜態法制備步驟決定了成膜介質上面生長和附著的微生物既有游離態(浮游微生物)也有聚集態(生物膜)。必須盡可能地清除浮游微生物，并最大限度地保留生物膜才能保證生物膜模型測試結果的可信度。因此，生物膜與成膜介質的結合穩定程度決定生物膜模型的成功與否。除此以外，特定菌種的培養環境也會嚴重影響生物膜的效果。