[發(fā)明專利]一種體外牙菌斑生物膜模型及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610035271.X
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105524869B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設計）人: 李淑鈺;江丹;黃亮;鐘美;張利萍
• 申請（專利權）人: 廣州立白企業(yè)集團有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/46;C12R1/04;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李德魁;張玲春

1.一種體外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：在無氧氣氛下，以厭氧菌培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質，以口腔致病菌作為菌種，以表面親水改性處理的細胞培養(yǎng)板作為成膜介質，以培養(yǎng)介質對口腔致病菌培養(yǎng)一段時間后，在成膜介質上生長一段時間，然后進行浮游微生物的去除，最后在成膜介質的表面獲得牙菌斑生物膜；

所述厭氧菌培養(yǎng)基選自胰蛋白胨大豆肉湯補加培養(yǎng)基和腦心浸出液肉湯富集培養(yǎng)基；

所述胰蛋白胨大豆肉湯補加培養(yǎng)基是指每升胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽、5毫克氯化血紅素、1毫克維生素K1；

所述腦心浸出液肉湯富集培養(yǎng)基是指每升腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽、5毫克氯化血紅素、1毫克維生素K1；

所述口腔致病菌選自血鏈球菌、變異鏈球菌、粘性放線菌、鼠李糖乳桿菌、牙齦卟啉單胞菌、和具核梭桿菌6種的混合；

其制備方法包括以下步驟：

1)分別將每種口腔致病菌在無氧氣氛、恒溫36℃的環(huán)境中在無菌平板上劃線培養(yǎng)2至6天，直至平板上出現(xiàn)大量菌苔；

2)分別將每種培養(yǎng)后的口腔致病菌接種到厭氧菌培養(yǎng)基，在無氧氣氛、恒溫36℃的環(huán)境中培養(yǎng)1至3天，直到培養(yǎng)基渾濁，標志菌懸液培養(yǎng)成熟；

3)將成熟的菌懸液按照體積比2％～8％的比例混合到厭氧菌培養(yǎng)基，在無氧氣氛、恒溫36℃的環(huán)境接種到表面親水改性處理的細胞培養(yǎng)板的小孔中，培養(yǎng)4至8小時；

4)吸取表面親水改性處理的細胞培養(yǎng)板小孔中的菌懸液，棄去；沿孔壁加入?yún)捬蹙囵B(yǎng)基至填滿小孔，吸取厭氧菌培養(yǎng)基，棄去；再次沿孔壁向小孔中加入?yún)捬蹙囵B(yǎng)基至填滿，吸取厭氧菌培養(yǎng)基，棄去；

5)保留經(jīng)厭氧菌培養(yǎng)基洗滌的、含有口腔致病菌生物膜的表面親水改性處理的細胞培養(yǎng)板小孔。

2.如權利要求1所述的體外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述L-半胱氨酸鹽酸鹽、氯化血紅素和維生素K1以溶液的方式添加至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，所述溶液具有以下的配置步驟：

1)0.5g/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液：將0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽溶解于1毫升去離子水中，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾，保留濾液，儲存溫度為4℃；

2)5g/L氯化血紅素水溶液：將0.5克氯化血紅素和1.74克磷酸氫二鉀，溶解于100ml去離子水中，煮沸助溶，0.22μm濾膜過濾，保留濾液，盛載濾液的容器以錫箔紙包裹外表面并避光儲存，儲存溫度為4℃；

3)5g/L維生素K1乙醇溶液：將50毫克維生素K1溶解于10毫升無水乙醇中，盛載溶液的容器以錫箔紙包裹外表面并避光儲存，儲存溫度為4℃。

3.如權利要求1所述的體外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述L-半胱氨酸鹽酸鹽、氯化血紅素和維生素K1以溶液的方式添加至腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基，所述溶液具有以下的配置步驟：

1)0.5g/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液：將0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽溶解于1毫升去離子水中，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾，保留濾液，儲存溫度為4℃；

2)5g/L氯化血紅素水溶液：將0.5克氯化血紅素和1.74克磷酸氫二鉀，溶解于100ml去離子水中，煮沸助溶，0.22μm無菌濾膜過濾，保留濾液，盛載濾液的容器以錫箔紙包裹外表面并避光儲存，儲存溫度為4℃；

3)5g/L維生素K1乙醇溶液：將50毫克維生素K1溶解于10毫升無水乙醇中，盛載溶液的容器錫箔紙包裹外表面并避光儲存，儲存溫度為4℃。

4.如權利要求1所述的體外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述無氧氣氛具體組成為：按體積比計，包含80％氮氣，10％氫氣，10％二氧化碳；所述表面親水改性處理的細胞培養(yǎng)板為聚苯乙烯材質；經(jīng)歷浮游微生物洗滌處理后的牙菌斑生物膜在表面親水改性處理的細胞培養(yǎng)板孔板底部的保留率大于90％。