[發明專利]一種提高大腸桿菌生產丁醇的方法

有效

• 申請號: 201610035150.5
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105505971B
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發明（設計）人: 董紅軍;趙春華;張延平;李寅
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P7/16;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種提高大腸桿菌生產丁醇的方法。本發明提供了一種構建重組菌的方法，為抑制或沉默生產丁醇的出發菌的基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh表達，得到重組菌。本發明的實驗證明，本發明中可促進大腸桿菌生產丁醇的改造靶點為蘋果酸脫氫酶基因(Genbank：NC_000913.3序列中的中的mdh基因(b3236))。通過λ?red同源重組系統敲除技術，在一株產丁醇的大腸桿菌工程菌株敲除mdh基因后，丁醇產量可提高283％，得率可提高89％。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提高大腸桿菌生產丁醇的方法。

背景技術

丁醇是一種重要的化學品，可直接用作有機溶劑和合成多種酯類化合物的前體，同時它也是一種比乙醇更有優勢的生物燃料。生物丁醇可由一些梭菌菌株在厭氧條件下經過ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)發酵產生，至今已有超過一百年的歷史。但是由于梭菌菌株本身是嚴格厭氧的革蘭氏陽性細菌，遺傳操作困難，并且由于本身復雜的代謝調控機制，因此很難提升梭菌發酵生產丁醇的能力，從而限制了生物丁醇市場競爭力。借助于現代生物技術，科學家開始利用易于操作的模式細菌大腸桿菌來生產丁醇，取得了顯著的進展。

2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先在大腸桿菌中實現了丁醇的合成(Atsumi S,Cann A F,Connor M R,et al.Metabolic engineering of Escherichia colifor 1-butanol production.Metabolic engineering,2008,10(6):305-311.)，該研究組將丙酮丁醇梭菌體內的丁醇合成途徑轉移至大腸桿菌內，致使其可產生少量丁醇。在隨后的幾年里，大量的相關工作逐漸開展和發表，目前報道最高的大腸桿菌丁醇產量是14-15g/L，接近了梭菌產量，但是與梭菌相比較并沒有表現出充分的優勢，還遠未達到有市場競爭力的產業化水平，仍需要更多的改進，比如產量、產率、底物利用等。因此還需要更進一步的菌株改造，提高丁醇生產性能，這就需要尋找新的有效改造靶點。

發明內容

本發明一個目的是提供了一種構建重組菌的方法。

本發明提供的方法，為抑制或沉默生產丁醇的出發菌基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh表達，得到重組菌。

上述方法中，上述抑制或沉默生產丁醇的出發菌基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh表達為敲除生產丁醇的出發菌基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh。

上述方法中，上述敲除生產丁醇的出發菌基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh采用λ-red同源重組系統、sacB基因介導篩選的同源重組系統或CRISPR/Cas系統。

上述方法中，上述敲除生產丁醇的出發菌基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh為采用λ-red同源重組系統將生產丁醇的出發菌基因組上的蘋果酸脫氫酶基因mdh替換為兩端帶有FRT的標記基因。

上述方法中，所述標記基因為卡那霉素抗性基因；

所述兩端帶有FRT的標記基因片段的核苷酸序列為序列表中序列2第41-1534位。

上述方法中，所述生產丁醇的出發菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌為將丙酮丁醇梭菌體內的丁醇合成途徑轉移至出發大腸桿菌得到的菌；

所述大腸桿菌具體為EB205CGMCC No.11985；

所述出發大腸桿菌為BW25113。

上述方法中，所述蘋果酸脫氫酶的氨基酸序列為序列3；

所述蘋果酸脫氫酶mdh基因的核苷酸序列具體為序列1。