[發明專利]一種基于熒光PCR法聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 201610033637.X
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN106755565A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 柯昌文;管大偉;肖紅;徐靜;邵俊斌;朱勤瑋;王凱;熊磊
• 申請（專利權）人: 廣東省疾病預防控制中心;上海之江生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海光華專利事務所31219
• 代理人: 嚴晨,許亦琳

技術領域

本發明涉及熒光PCR檢測試劑盒領域，特別是涉及一種基于熒光PCR法聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒。

背景技術

登革熱病毒是小型黃病毒，屬于黃熱病毒屬，能引起一系列臨床癥狀，包括有生命危險的失血性休克綜合征和較少見的伴有肝衰與腦病的急性肝炎。以埃及伊蚊和白紋伊蚊為傳播媒介，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶的60多個國家和地區，每年大約超過一億人受到感染，死亡率高達50％，25億以上的人受到威脅，該病毒的傳播已成為熱帶、亞熱帶地區嚴重的公共衛生問題。在大多數國家登革熱的死亡率大約為5％，大多發生在兒童和青壯年中。

基孔肯亞病毒屬于披膜病毒科的甲病毒屬，在疾病流行地區，這種病毒可存在于綠猴、狒狒、黑猩猩、牛、馬、豬、兔等多種動物體內，受感染的動物宿主和病人都是傳染源。該病毒由受感染蚊子叮咬傳播，能引起一種少見的病毒性傳染病——基孔肯亞熱。基孔肯亞熱一般持續五到七天，常會引起嚴重的關節痛使人失去能力，這種狀況最終可以恢復，但劇烈疼痛和恢復緩慢的特點可明顯影響人的正常生活和工作。2006年在印度和南亞的一次流行中，不止125萬人感染基孔肯亞熱病毒。2007年9月，意大利北部通報了由一例輸入病例引起的一次基孔肯亞熱暴發。基孔肯亞熱近年來急劇復蘇并擴大了地域范圍，突出表明了我們對昆蟲傳播的新傳染病的脆弱性，并強調了作為衛生安全基本要素的持續控制規劃的重要性。

基孔肯亞熱與登革熱的傳播媒介相同，流行區域基本相同，臨床表現亦類似，與登革熱較難鑒別，兩者鑒別有賴于實驗室特異性檢測。

熒光RT-PCR技術是上世紀九十年代末才發展起來的新技術，它具有快速、特異性、靈敏度高、成本相對低等優點，被廣泛應用于臨床檢測的各個方面。目前已開發出利用熒光定量PCR技術分別針對上述兩種病毒進行的快速檢測試劑盒，但是由于是單一檢測，兩種病毒檢測下來，既麻煩又浪費成本。因此在熒光RT-PCR技術的基礎上，建立單管聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的方法具有非常重要的意義。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種基于熒光PCR法聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒，所述試劑盒包括針對登革熱病毒的特異性引物、登革熱病毒探針、針對基孔肯亞病毒的特異性引物以及基孔肯亞病毒探針，所述針對登革熱病毒的特異性引物包括正向引物和反向引物，針對登革熱病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，針對登革熱病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述針對基孔肯亞病毒的特異性引物包括正向引物和反向引物，針對基孔肯亞病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，針對基孔肯亞病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

優選的，所述登革熱病毒探針的探針序列如SEQ ID No.5所示。

更優選的，所述登革熱病毒探針兩端標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。

進一步優選的，所述登革熱病毒探針5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團，具體可選用的熒光報告基團包括但不限于FAM、VIC/HEX、RED610、HEX等中的一種或多種的組合。在本發明一實施例中，所述熒光報告基團為FAM熒光基團，所述熒光淬滅基團為BHQ1。

優選的，所述基孔肯亞病毒探針的探針序列如SEQ ID No.6所示。

更優選的，所述基孔肯亞病毒探針兩端標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。

進一步優選的，所述基孔肯亞病毒探針5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團，具體可選用的熒光報告基團包括但不限于FAM、VIC/HEX，RED610、HEX等中的一種或多種的組合。在本發明一實施例中，所述熒光報告基團為HEX熒光基團，所述熒光淬滅基團為BHQ1。

本發明所提供的試劑盒中，登革熱病毒探針上標記的熒光報告基團和基孔肯亞病毒探針上標記的熒光報告基團不相同且熒光波長不相同，優選情況下，兩種熒光報告基團的熒光波長相差較大、信號強度相近，保證了檢測結果的準確性，避免了信號之間的相互干擾。

優選的，所述試劑盒還包括RNA抽提試劑、RT-PCR試劑、內部對照體系和陽性對照中的一種或多種的組合。