[發明專利]一種基于熒光PCR法聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 201610033637.X
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN106755565A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 柯昌文;管大偉;肖紅;徐靜;邵俊斌;朱勤瑋;王凱;熊磊
• 申請（專利權）人: 廣東省疾病預防控制中心;上海之江生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海光華專利事務所31219
• 代理人: 嚴晨,許亦琳

1.一種聯合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒，所述試劑盒包括針對登革熱病毒的特異性引物、登革熱病毒探針、針對基孔肯亞病毒的特異性引物以及基孔肯亞病毒探針，所述針對登革熱病毒的特異性引物包括正向引物和反向引物，針對登革熱病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，針對登革熱病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述針對基孔肯亞病毒的特異性引物包括正向引物和反向引物，針對基孔肯亞病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，針對基孔肯亞病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒探針的探針序列如SEQ ID No.5所示，所述基孔肯亞病毒探針的探針序列如SEQ ID No.6所示。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒探針和基孔肯亞病毒探針兩端標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒探針5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團，所述基孔肯亞病毒探針5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

5.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒探針上標記的熒光報告基團和基孔肯亞病毒探針上標記的熒光報告基團不相同且熒光波長不相同。

6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括RNA抽提試劑、RT-PCR試劑、內部對照體系和陽性對照中的一種或多種的組合。

7.一種登革熱病毒和基孔肯亞病毒的聯合檢測方法，使用如權利要求1-6任一權利要求所述的試劑盒，具體包括如下步驟：

1)標本的核酸提取：使用病毒RNA抽提試劑盒提取標本RNA；

2)核酸熒光PCR檢測混合液的配制：將針對登革熱病毒的特異性引物、登革熱病毒探針、針對基孔肯亞病毒的特異性引物、基孔肯亞病毒探針、內部對照品探針、RT-PCR預混液、工藝用水組成核酸熒光PCR檢測混合液體系；

3)試劑配制：將核酸熒光PCR檢測混合液體系、內部對照品、RT-PCR酶振蕩混勻、離心；

4)加樣：將步驟3所得混合液置于PCR管中，然后將步驟1所得標本、陽性對照品、DEPC-H₂O分別加入PCR管中，離心后立即進行PCR擴增反應；

5)通過定量熒光PCR儀器對樣品進行PCR反應，并通過熒光信號的強度判斷登革熱病毒和基孔肯亞病毒的陽性和陰性。