[發(fā)明專利]凍存臍血細(xì)胞誘導(dǎo)DC-CIK細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610032666.4
• 申請(qǐng)日: 2016-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN105567633A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王秋鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王秋鳳
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 北京商專永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合制備方法，特別涉及一種凍存臍血細(xì)胞誘導(dǎo)DC-CIK細(xì) 胞的方法。

背景技術(shù)

1973年Steiman和Cohn首次從脾臟中分離出一類與粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞 形態(tài)和功都不同的白細(xì)胞，因其細(xì)胞膜向外伸出，形成與神經(jīng)細(xì)胞軸突相似的膜性樹狀突 起，故而命名為樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)。DC細(xì)胞是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)、唯一能 活化靜息T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。通過大量 體外活化培養(yǎng)負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定數(shù)量后回輸給病人，可誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞CD3+和CD56+細(xì)胞在正常人外周血中極其罕見，僅1％— 5％。目前國內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的CIK細(xì)胞，實(shí)際上是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在 體外用多種細(xì)胞因子(如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等)共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的 一群以CD3+、CD56+、CD8+為主的異質(zhì)細(xì)胞。由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+兩種膜蛋白 分子，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC 限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。因此，應(yīng)用CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的重要方 案。

CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞是細(xì)胞免疫治療的2個(gè)重要組成部分，兩者聯(lián)合使用可確保高效 的免疫反應(yīng)。

現(xiàn)有技術(shù)中，采用健康人外周血進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)DC-CIK，由于外周血中的造血干細(xì) 胞較少，致使其誘導(dǎo)效率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)和富集過程簡(jiǎn)單易行、周期短、成本低廉、誘導(dǎo)效率 高、富集后細(xì)胞活力好的凍存臍血細(xì)胞誘導(dǎo)DC-CIK細(xì)胞的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種凍存臍血細(xì)胞誘導(dǎo)DC-CIK 細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

(1)復(fù)蘇凍存臍血細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；

(2)DC細(xì)胞制備：反復(fù)吹打步驟(1)中的培養(yǎng)瓶壁，得到DC貼壁細(xì)胞，收取懸浮細(xì)胞 移入另一培養(yǎng)瓶中做CIK細(xì)胞培養(yǎng)備用，在DC細(xì)胞完全培養(yǎng)基加入GM-CSF和IL-4后添加至 具有DC貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得DC細(xì)胞；

(3)CIK細(xì)胞制備：將收集步驟(2)的懸浮細(xì)胞調(diào)整密度，加入IFN-Y，培養(yǎng)20～24小 時(shí)后，加入IL-2、IL-1a、和CD3MAb，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得CIK細(xì)胞。

本發(fā)明的凍存臍血細(xì)胞誘導(dǎo)DC-CIK細(xì)胞的方法的凍存臍血具有較多的造血干細(xì) 胞，以及采用多細(xì)胞誘導(dǎo)因子，使本方法具有誘導(dǎo)效率高、重復(fù)性好、富集后細(xì)胞活力好的 特點(diǎn)。本方法操作步驟簡(jiǎn)單，使誘導(dǎo)和富集過程簡(jiǎn)單易行、周期短、成本低廉。

在一些實(shí)施方式中，在步驟(2)中，反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶壁收取懸浮細(xì)胞后，向培養(yǎng)瓶 加入GT-T515無血清培養(yǎng)基，再次反復(fù)吹打瓶壁收取懸浮細(xì)胞，重復(fù)上述操作，直至在顯微 鏡下能夠清晰觀察DC貼壁細(xì)胞。

在一些實(shí)施方式中，在步驟(2)中，DC細(xì)胞培養(yǎng)8～14天，細(xì)胞培養(yǎng)第一天添加因子 IFN-Y至終濃度1000IU/ml。

在一些實(shí)施方式中，在收取DC細(xì)胞前添加腫瘤抗原至終濃度50ng/ml，

在步驟(2)中，DC細(xì)胞培養(yǎng)第4天進(jìn)行2/3換液，補(bǔ)液中GM-CSF終濃度為1000IU/ml、 IL-4終濃度為500IU/ml。

在一些實(shí)施方式中，在步驟(2)DC細(xì)胞培養(yǎng)過程中，若培養(yǎng)液變橙黃色則按原培養(yǎng) 液體積25％補(bǔ)液，補(bǔ)液中GM-CSF終濃度為1000IU/ml、IL-4終濃度為500IU/ml。

在一些實(shí)施方式中，在步驟(3)中調(diào)整懸浮細(xì)胞密度最低密度調(diào)整為10⁸個(gè)/ml。

在一些實(shí)施方式中，在步驟(3)中，CIK細(xì)胞培養(yǎng)12～16天，細(xì)胞培養(yǎng)第一天添加因 子IFN-Y至終濃度1000IU/ml，細(xì)胞培養(yǎng)第二天添加因子IL-2至終濃度為1000IU/ml，IL-1a 至終濃度為500IU/ml，CD3MAb至終濃度為375ng/ml。