[發明專利]凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法

在審

• 申請號: 201610032666.4
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105567633A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 王秋鳳
• 申請（專利權）人: 王秋鳳
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

1.凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)復蘇凍存臍血細胞，在培養瓶中進行貼壁培養；

(2)DC細胞制備：反復吹打步驟(1)中的培養瓶壁，得到DC貼壁細胞，收取懸浮細胞移入 另一培養瓶中做CIK細胞培養備用，在DC細胞完全培養基加入GM-CSF和IL-4后添加至具有 DC貼壁細胞的培養瓶中進行培養，獲得DC細胞；

(3)CIK細胞制備：將收集步驟(2)的懸浮細胞調整密度，加入IFN-Y，培養20～24小時 后，加入IL-2、IL-1a、和CD3MAb，進行細胞培養，獲得CIK細胞。

2.根據權利要求1所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (2)中，反復吹打培養瓶壁收取懸浮細胞后，向培養瓶加入GT-T515無血清培養基，再次反復 吹打瓶壁收取懸浮細胞，重復上述操作，直至在顯微鏡下能夠清晰觀察DC貼壁細胞。

3.根據權利要求1所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (2)中，DC細胞培養8～14天，細胞培養第一天添加因子IFN-Y至終濃度1000IU/ml。

4.根據權利要求1所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在收取DC 細胞前添加腫瘤抗原至終濃度50ng/ml。

5.根據權利要求3所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (2)中，DC細胞培養第4天進行2/3換液，補液中GM-CSF終濃度為1000IU/ml、IL-4終濃度為 500IU/ml。

6.根據權利要求3所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (2)DC細胞培養過程中，若培養液變橙黃色則按原培養液體積25％補液，補液中GM-CSF終濃 度為1000IU/ml、IL-4終濃度為500IU/ml。

7.根據權利要求1所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (3)中調整懸浮細胞密度最低密度調整為10⁸個/ml。

8.根據權利要求1所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (3)中，CIK細胞培養12～16天，細胞培養第一天添加因子IFN-Y至終濃度1000IU/ml，細胞培 養第二天添加因子IL-2至終濃度為1000IU/ml，IL-1a至終濃度為500IU/ml，CD3MAb至終濃 度為375ng/ml。

9.根據權利要求8所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (3)CIK細胞培養過程中，若培養液變橙黃色則按原培養液體積20％補液，補液中IL-2終濃 度為1000IU/ml，IL-1a終濃度為500IU/ml，CD3MAb終濃度為375ng/ml。

10.根據權利要求8所述的凍存臍血細胞誘導DC-CIK細胞的方法，其特征在于，在步驟 (3)CIK細胞培養第4天和第8天均進行2/3換液，補液中IL-2終濃度為1000IU/ml，IL-1a終濃 度為500IU/ml，CD3MAb終濃度為375ng/ml。