[發明專利]一種基于銀沉積的甲胎蛋白電化學免疫傳感器的制備及應用

在審

• 申請號: 201610032292.6
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105628931A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 鄭香麗;周長利;夏方詮;田棟;花小霞;喬雪瑩
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/48
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 李茜

技術領域

本發明涉及電化學免疫傳感技術領域，特別是涉及一種基于銀沉積的甲胎蛋白(AFP)電化學免疫傳感器的制備及應用。具體是利用金納米簇修飾玻碳電極表面作為抗體捕獲基底，C₆₀負載金納米復合物跟蹤標記AFP第二抗體，通過夾心免疫反應，第二抗體功能化的金納米被捕獲到傳感器的表面并誘導銀沉積，通過檢測銀納米在KCl溶液中的電化學溶出信號實現AFP的檢測。

背景技術

靈敏準確的檢測腫瘤標志物對于疾病的早期治療和診斷具有至關重要的作用，腫瘤標志物在血清、組織、唾液中的含量能夠反映癌癥在一個特定時間的生理狀態。AFP作為一種腫瘤標志物主要在胎兒肝中合成，在正常人血清中AFP的含量不高于20μg/L，然而當成人體內肝細胞發生癌變時血清中的含量會明顯增加。因此，AFP常被作為診斷原發性肝癌的特異性腫瘤標志物。目前常用化學發光法、酶標法、酶標電泳法、放射免疫法檢測。這些分析方法通常存在操作復雜，價格昂貴，不適合實時檢測的缺陷。因此，發展快速、靈敏的分析方法去定量檢測AFP對肝癌的早期發現、早期診斷和早期治療具有重大意義。電化學免疫傳感器由于所需儀器設備簡單，靈敏度高，檢測速度快，成本低，尤其是滿足實時檢測的需要而備受人們的廣泛關注?；陔娀瘜W傳感器的優良性質本發明制備了一種基于銀沉積的AFP電化學免疫傳感器，以銀沉積作為電化學信號輸出方式實現對AFP的檢測。

本發明中金納米簇作為第一抗體捕獲基底，由于其良好的生物相容性，優異的導電性和大的表面積，不僅可以負載更多的抗體，而且可以促進蛋白質和電極之間的電子傳遞。C₆₀負載金納米復合物跟蹤標記AFP第二抗體，通過夾心免疫反應，第二抗體功能化的金納米被捕獲到傳感器的表面并誘導銀沉積，通過檢測銀納米在KCl溶液中的電化學溶出信號實現AFP的檢測。在本發明中構建的電化學免疫傳感器具有成本低，穩定性好，制備過程簡單，靈敏度高等優點。

發明內容

本發明的目的之一是以C₆₀負載金納米復合物作為跟蹤標記AFP第二抗體的載體，并利用第二抗體功能化的金納米誘導銀沉積，以銀沉積作為電化學信號的輸出方式，構建了一種簡單快速，穩定性好，靈敏度高的電化學免疫傳感器。

本發明的目的之二是將該電化學免疫傳感器用于AFP的檢測。

本發明的技術方案為：

1.一種基于銀沉積的AFP電化學免疫傳感器的制備方法：

(1)用Al₂O₃拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3min，氮氣吹干；以10mL含有濃度為1.0mmoL/L的HAuCl₄溶液為底液，以GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極在-0.8～0.6V電位范圍內進行循環伏安掃描30圈后，將電極在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡過夜，用PBS(pH7.4)緩沖液沖洗得到金納米簇修飾玻碳電極(nano-Au/GCE)；

(2)取10μL1.0~2.5μg/mL的AFP第一抗體(Ab₁)標準溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到Ab₁/nano-Au/GCE；

(3)取10μL質量分數為1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Ab₁/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封閉非特異性結合位點，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(4)將10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同濃度的AFP標準溶液滴涂到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE表面用于與抗體特異性識別，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到AFP/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；