[發明專利]一種基于銀沉積的甲胎蛋白電化學免疫傳感器的制備及應用

在審

• 申請號: 201610032292.6
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105628931A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 鄭香麗;周長利;夏方詮;田棟;花小霞;喬雪瑩
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/48
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 李茜

1.一種基于銀沉積的甲胎蛋白(AFP)電化學免疫傳感器的制備及應用，其特征在于包括以下步驟：

(1)用Al₂O₃拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3min，氮氣吹干；以10mL含有濃度為1.0mmoL/L的HAuCl₄溶液為底液，以GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極在-0.8～0.6V電位范圍內進行循環伏安掃描30圈后，將電極在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡過夜，用PBS(pH7.4)緩沖液沖洗得到金納米簇修飾玻碳電極(nano-Au/GCE)；

(2)取10μL1.0~2.5μg/mL的AFP第一抗體(Ab₁)標準溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到Ab₁/nano-Au/GCE；

(3)取10μL質量分數為1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Ab₁/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封閉非特異性結合位點，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(4)將10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同濃度的AFP標準溶液滴涂到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE表面用于與抗體特異性識別，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到AFP/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(5)滴加6~10μLAuNPsPAMAM-C₆₀標記AFP第二抗體(Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀)到上述電極表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，再取10μL4~10mmoL的銀增強劑滴涂到電極表面室溫下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于銀沉積的甲胎蛋白電化學免疫傳感器(Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀/AFP/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE)。

2.根據權利要求1所述的一種基于銀沉積的甲胎蛋白電化學免疫傳感器的制備及應用，其特征在于所述步驟(5)中Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀的具體制作步驟為：

(1)AuNPsPAMAM-C₆₀的制備

在磁力攪拌下，將1.0mg的樹枝狀高分子聚酰胺(PAMAM)加入到1mL超純水中，然后加入4mL乙醇繼續攪拌使得溶液充分混勻，將1mL1.0mg/mL的C₆₀的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室溫下持續攪拌36h，用超純水離心洗滌3次得到PAMAM-C₆₀；將PAMAM-C₆₀重新分散到2mLPBS(pH7.4)緩沖溶液中；取97mL的超純水于錐形瓶，在攪拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl₄和1mL的0.03mol/L檸檬酸二鈉，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氫化鈉至溶液變為亮酒紅色，再攪拌15min得金納米溶液；取2mL上述金納米溶液于2mLPAMAM-C₆₀分散液中室溫下攪拌過夜，所得溶液在8000r/s離心，棄去上清液，重新溶解到2mLPBS(pH7.4)緩沖溶液中，得到AuNPsPAMAM-C₆₀溶液；

(2)Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀的制備

取0.2mL10μg/mL的Ab₂在攪拌的條件下加入到2mLAb₂-AuNPsPAMAM-C₆₀溶液中，室溫下攪拌30min后在4℃下孵育過夜，得到的混合溶液在9000r/s離心15min，棄去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)緩沖溶液中，得到Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀溶液。

3.根據權利要求1所述的制備方法制備的一種基于銀沉積的甲胎蛋白電化學免疫傳感器的制備及應用，其特征在于，用于AFP的檢測，檢測步驟如下：

(1)實驗在電化學工作站上進行，采用三電極體系以所制備的免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極，在PBS(pH7.4)緩沖溶液中進行測試；

(2)用線性掃描伏安法對一系列不同濃度AFP標準溶液及未特異性結合AFP的電極進行檢測，掃描的電位區間為-0.1V~0.5V，掃描速度為50mV/s，記錄示差脈沖伏安圖，根據所得的峰電流值和AFP濃度的對數呈線性關系，繪制工作曲線；

(3)將待測樣品溶液代替AFP標準溶液進行檢測。