[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610031644.6
• 申請(qǐng)日: 2016-01-19
• 公開（公告）號(hào): CN105651993B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴衛(wèi)華;王景云;劉道峰;鄧省亮;山珊;熊勇華;魏華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558;G01N33/577
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)納米微球的制備：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮?dú)獠⒓訜岬?0-120℃，然后將3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反應(yīng)2h；用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3～5次，得Fe₃O₄納米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再將10-300μL正硅酸乙酯溶解在50μL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應(yīng)12h，在Fe₃O₄納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復(fù)溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子；

c.把10-300μL的正硅酸乙酯，20mL無(wú)水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉聯(lián)釕(Ru(bqy)₃²⁺)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，劇烈攪拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，用去離子水清洗備用；

d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復(fù)溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；

e.將硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球添加到包含0.06g NaHCO₃，0.08g十二烷基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g過(guò)硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下攪拌，反應(yīng)5h后得羧基化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；

2)取0.5-2mg羧基化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球加入1mL偶聯(lián)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，及60-200μg抗金黃色葡萄球菌單抗，在溫度37℃時(shí)，放在10-15rpm的旋轉(zhuǎn)儀上偶聯(lián)60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取1mL封閉劑與納米微球混合封閉0.5-1h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗；

所述偶聯(lián)緩沖液配制方法如下：將3mL 19.07g/mL的硼砂與7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀釋10倍體積；

所述清洗緩沖液配制方法如下：稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的無(wú)菌蒸餾水中，調(diào)pH為5.5-6.0；

所述封閉劑配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸鹽(PBS)緩沖液配成封閉劑；

3)培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，將菌液調(diào)整濃度為10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL，各取1mL備用；取待測(cè)樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與100-150μg Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗，于溫度37℃，旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分離3-5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復(fù)溶于PBS中得Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗-菌；

4)免疫層析試紙條的制備：將樣本墊用含1％BSA，0.5％Tween-20的pH 8.5 0.1M Tris-HCl緩沖液浸泡處理，置于60℃鼓風(fēng)干燥箱，2h后取出備用；將金黃色葡萄球菌兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，濃度均為1-2mg/mL，噴量均為0.75μL/cm，37℃真空干燥過(guò)夜，取出置于干燥缸中備用；將過(guò)濾墊、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的試紙條，裝卡；將制備好的試紙條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存?zhèn)溆茫?/p>

5)試紙條對(duì)樣品的檢測(cè)：將收集到的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗-菌稀釋到50-150μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強(qiáng)度和T/C的值；

6)定性分析：用肉眼觀察結(jié)果進(jìn)行定性分析，T線顯色則說(shuō)明樣品中有金黃色葡萄球菌，T線不顯色則說(shuō)明樣品中沒有金黃色葡萄球菌或是含有金黃色葡萄球菌的量低于10³CFU/mL；

7)定量分析：使用熒光讀取儀測(cè)量T線、C線的熒光強(qiáng)度，以及T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標(biāo)，T/C值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定普通樣品中的金黃色葡萄球菌數(shù)量。