[發明專利]一種快速檢測金黃色葡萄球菌的方法

有效

• 申請號: 201610031644.6
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105651993B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 賴衛華;王景云;劉道峰;鄧省亮;山珊;熊勇華;魏華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體采用Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球集成免疫磁珠捕獲技術和免疫層析快速檢測金黃色葡萄球菌。

技術背景

金黃色葡萄球菌是最常見的食物中毒病原菌之一，在自然界中隨處可見。因此，食品受其污染的機率很大。據美國疾病控制中心報告，金黃色葡萄球菌引發的食物中毒僅次于大腸桿菌占第二位，占整個細菌性食物中毒的33％，加拿大則高達45％。金黃色葡萄球菌是引起臨床感染及手術切口感染的主要致病菌之一，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感，但抗生素的廣泛應用致使金黃色葡萄球菌耐藥菌株的大量出現，使其造成的感染成為與乙型肝炎，艾滋病并列的世界三大感染頑疾。

目前檢測金黃色葡萄球菌的金標準是傳統分離鑒定法，該方法需經過預增菌、選擇性增菌、分離培養、生理生化鑒定及血清型鑒定等步驟，整個過程繁瑣耗時(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及生物傳感器法對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度高，然而它們需要較長的檢測時間、昂貴的儀器以及專業的技術人員。因此，建立快速、簡單、靈敏的檢測方法對食源性致病菌的檢測具有重要意義。

膠體金免疫層析試紙條以其操作簡單、快速(10-15min)、準確等特點成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學信號有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對金黃色葡萄球菌的檢測限通常不高于10⁵CFU/mL，這個缺陷限制了其在食品和農產品檢測中的應用。因此，提高試紙條的靈敏度將為金黃色葡萄球菌的檢測提供簡單、高效的途徑。

發明內容

本發明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的金黃色葡萄球菌定性、定量檢測技術。

本發明具體方案如下：

一種快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟：

1)納米微球的制備：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮氣并加熱到80-120℃，然后將3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反應2h；用永磁鐵從反應溶液中分離出黑色的固體物質用高純水清洗3～5次，得Fe₃O₄納米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應12h，在Fe₃O₄納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉聯釕(Ru(bqy)₃²⁺)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，劇烈攪拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，用去離子水清洗備用；

d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；