[發(fā)明專利]用于雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR分型檢測的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610029744.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN105463136B
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖敏;雷靜;周繼勇;方祥年
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供一種用于雞傳染性支氣管炎病毒RT?PCR分型檢測的試劑盒。該試劑盒包括下述三對(duì)引物：根據(jù)傳染性支氣管炎病毒的S1基因片段設(shè)計(jì)的通用引物和4/91類型毒株特異性引物，以及根據(jù)nsp12基因片段設(shè)計(jì)的腎型毒株特異性引物，所述三對(duì)引物的序列如SEQ ID NO:6～11所示。本發(fā)明提供的試劑盒僅需通過一次RT?PCR反應(yīng)就能達(dá)到對(duì)IBV進(jìn)行分型檢測目的，是業(yè)內(nèi)首次用一次性RT?PCR的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)腎型、4/91類型、呼吸型三種類型IBV毒株的鑒別檢測。本發(fā)明具有使用方便快捷、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為臨床上IBV的快速鑒別診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及IB的防控提供了一種新的有效的檢測手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR分型檢測試劑盒。

背景技術(shù)

雞的傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis Virus,IBV)引起的雞急性，高度接觸性傳染病。以呼吸困難，腎炎和蛋品質(zhì)下降為主要特征，該病在全世界廣泛流行，是養(yǎng)雞業(yè)中危害最嚴(yán)重的呼吸道傳染病之一。

IBV隸屬于套式病毒目(Nidovirilaes)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)γ冠狀病毒亞屬，是該亞群的代表病毒，也是最早分離獲得的冠狀病毒。雞傳染性支氣管炎病毒在世界范圍內(nèi)廣泛流行，而且不同的病毒對(duì)組織的親嗜性不同，主要有呼吸型、腎型、腸型、生殖型和腺胃型等。由于IBV RNA特有的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，加上RNA酶缺乏校正系統(tǒng)導(dǎo)致IBV很容易發(fā)生變異，出現(xiàn)了復(fù)雜的組織嗜性、血清型和基因型。IBV變異株的出現(xiàn)，使現(xiàn)有疫苗不能很好保護(hù)雞群抵抗野毒的攻擊，養(yǎng)雞場IB的暴發(fā)時(shí)有發(fā)生，給IB的防控帶來了很大的困難。因此，有必要對(duì)流行的IBV毒株類型進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，給疫苗的使用提供及時(shí)的指導(dǎo)。

IBV為單股正鏈RNA病毒，基因組長約為27.4kb。在基因組RNA轉(zhuǎn)錄過程中形成6種mRNA，即mRNA 1～6，編碼6種基因。其中基因1又稱多聚酶基因(Ploymerase Gene)，編碼兩個(gè)大的融合蛋白，即多聚蛋白1a和1b，多聚蛋白被蛋白酶水解形成15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，nsp)，參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄?；?編碼纖突蛋白(Spike,S)，基因4編碼膜蛋白(Membrane,M)，基因6編碼核衣殼蛋白(Nucleocapsid,N)。另還有基因3編碼3a、3b和小膜蛋白(Envelope,E)，基因5編碼5a和5b蛋白。S、M、N和E是結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒粒子的組成；3a、3b、5a和5b分子量小，功能未知。S蛋白具有免疫原性，被水解為兩個(gè)亞基，S1和S2，其中S1蛋白決定IBV的血清型，并影響著病毒的組織嗜性。

根據(jù)IBV的基因組及其基因片段的遺傳進(jìn)化分析，組織嗜性類似的毒株歸入同一遺傳進(jìn)化分支里，這些毒株的基因具有較高的同源性。因此，根據(jù)基因的信息可以將毒株進(jìn)行分型。目前國內(nèi)流行的IBV毒株從表現(xiàn)型上主要以呼吸型和腎型為主。4/91類型毒株最先在國外報(bào)道，此后在世界上許多國家流行起來，該型毒株的S1基因與其它許多類型毒株的異源性超過25％，且沒有血清學(xué)交叉反應(yīng)性，是當(dāng)前世界上用于制備商品化疫苗的主要毒株之一。因此，對(duì)4/91類型毒株分型鑒定具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR分型檢測的試劑盒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

提供一種用于雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR分型檢測的試劑盒，該試劑盒包括下述三對(duì)引物：根據(jù)傳染性支氣管炎病毒的S1基因片段設(shè)計(jì)的通用引物和4/91類型毒株特異性引物，以及根據(jù)nsp12基因片段設(shè)計(jì)的腎型毒株特異性引物；所述三對(duì)引物的序列如SEQID NO:6～11所示：

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