[發明專利]用于檢測SEPT9基因甲基化的組合物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201610029275.7
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105506133A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 張良祿;殷雷;洪昊巖
• 申請（專利權）人: 武漢艾米森生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于基因甲基化快速分子診斷領域，具體涉及用于檢測SEPT9基因甲基化 的組合物與試劑盒以及方法。

背景技術

結直腸癌(CRC)是世界第三常見惡性腫瘤，每年新發病例數約120萬，約死亡病例 數約61萬人(2008年)。近20多年來，世界上多數國家結直腸癌(主要是結腸癌)發病率呈上 升趨勢。在美國每年約有15.4萬新發直結腸癌患者，其中每年死亡人數超過5.2萬。中國結 直腸癌發病率上升趨勢也十分明顯。中國每年有超過40萬新發直結腸癌患者，直結腸癌死 亡19.5萬，平均增速為4.2％遠超過國際平均水平的2％。

根據世界衛生組織統計表明，北美國家直結腸癌患者5年生存率約為60％，而中國 對應僅有32％。直結腸癌生存期與疾病的嚴重程度、分期相關，由于我國在直結腸癌的診斷 水平，民眾早診意識等方面薄弱，80％以上為中晚期患者，早期診斷比例僅為11.8％。而有 效的早期直結腸癌患者可使直結腸癌發病率降低60％，病死率降低80％。

目前，直結腸癌非侵入式檢測方法用于疾病的篩查有效力非常低下，因為需要患 者每年收集糞便樣本便潛血試驗或糞便免疫化學熒光檢測，假陽性比率高，結果穩定性差， 總體受檢率小于3％。盡管乙狀結腸鏡檢查或結腸鏡檢查檢出率較高，是直結腸癌檢查的金 標準，但是需要患者做清理腸道準備、依靠麻醉并且侵犯隱私，患者會產生恐懼心理，檢查 出血或者感染等情況，總體依從性較差，受檢率小于5％。因此，高特異性、高靈敏度、依從性 好、非侵入式的直結腸癌早期診斷技術亟待解決。

DNA甲基化是調節基因表達轉錄的表觀遺傳方式之一，普遍存在與哺乳動物中。 DNA甲基化主要發生在基因上游啟動子CpG到的胞嘧啶上，形成CpG基因島，關閉下游基因的 表達。異常的DNA甲基化對基因表達的調控是腫瘤發生發展中的重要特點之一，并且在直結 腸癌中被廣泛驗證。近年來，研究者發現患者血漿中大量基因甲基化包括p16、BMP3、NDRG4、 SEPT9等與直結腸癌的發生、發展相關。其中，SEPT9(或成為septin9)是廣泛存在于真核生 物中的進化上保守的細胞骨架GTPase蛋白，參與多項細胞生命活動包括細胞分裂、極化、細 胞凋亡等。血漿中SEPT9基因V2拼接體啟動子甲基化與直結腸癌的發生和發展密切相關，基 因甲基化情況能有效區分直結腸癌患者與健康人群，可單獨作為直結腸癌診斷、預后的指 標。

針對SEPT9基因V2拼接體啟動子甲基化水平有CN201410452285.2、 CN201410030771.5和CN201510264501.5。CN201410452285.2根據甲基化與非甲基化亞硫酸 氫鹽處理后序列不同，PCR擴增的溫度溶解曲線不同而產生不同的熒光峰值，來對SEPT9基 因甲基化進行檢測與定量。然而高分辨溶解曲線僅能在如LightCyclerTM480PCR或 LightScanner等少量儀器可以使用，并且技術要求高，不利于廣泛推廣。CN201410030771.5 采用五對引物、五條Blocker和五條探針對SEPT9基因甲基化，檢測成本較高，擴增反應復 雜，易出現引物、探針干擾導致檢測結果不穩定。CN201510264501.5通過引入脫氧次黃嘌呤 核苷酸堿基(I)，檢測時需同步進行兩個反應體系，檢測結果由兩個反應體系進行比較獲 得，檢測成本較高且結果判讀復雜。

發明內容

本發明針對現有的不足，提供了一種利用一對引物、一條阻攔序列(即Blocker)和 一條探針檢測患者血液中SEPT9基因V2拼接體啟動子甲基化水平的簡易方法，具有成本低 廉、檢測方便、靈敏性高的特點。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

SEPT9基因V2拼接體啟動子甲基化的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，為GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGATTTGTTAATAGTTGGATGGGATTATTTCGG，其中，加粗部分核苷酸為SEPT9基因V2拼接體啟動子甲基化位點。

本發明提供一種用于檢測SEPT9基因甲基化的組合物，包括上游檢測引物和下游 檢測引物構成的引物對；

所述上游檢測引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的 核苷酸序列為5'-AAATAATCCCATCCAACTA-3'；