[發(fā)明專利]用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物、試劑盒及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610029275.7
• 申請(qǐng)日: 2016-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105506133A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張良祿;殷雷;洪昊巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢艾米森生命科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 陳衛(wèi)

1.用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征在于，包括上游檢測(cè)引物和下游檢測(cè)引 物構(gòu)成的引物對(duì)；

所述上游檢測(cè)引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷 酸序列為5′-AAATAATCCCATCCAACTA-3′；

所述下游檢測(cè)引物包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷 酸序列為5′-TTAACCGCGAAATCCGAC-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征在于，還包括阻攔 序列，所述阻攔序列用于結(jié)合非甲基化SEPT9基因，在甲基化SEPT9基因經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn) 化后的產(chǎn)物中，該阻攔序列在PCR反應(yīng)退火過(guò)程中優(yōu)先于權(quán)利要求1所述的引物對(duì)結(jié)合非甲 基化SEPT9基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征在于，所述阻攔序 列包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，并在3′端具有3′-SpacerC3。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征在于，還 包括檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針與引物對(duì)中的上游檢測(cè)引物或下游檢測(cè)引物匹配。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征在于，所述檢測(cè)探 針包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征在于，所述檢測(cè)探 針的5′端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述檢測(cè)探針的3′端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、5或6任一項(xiàng)所述用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，其特征 在于，還包括內(nèi)標(biāo)引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)探針；

所述內(nèi)標(biāo)引物對(duì)包括上游內(nèi)標(biāo)引物和下游內(nèi)標(biāo)引物，

上游內(nèi)標(biāo)引物包括SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.5所示的核苷酸序 列為5′-TTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3′，

下游內(nèi)標(biāo)引物包括SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.6所示的核苷酸序 列為5′-CACCAACCTCATAACCTTATC-3′；

內(nèi)標(biāo)探針包括SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.7所示的核苷酸序列為 5′-CCACGGACGATAGTGTTGTGG-3′，內(nèi)標(biāo)探針的5′端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述內(nèi)標(biāo)探針的3′端標(biāo) 記有淬滅基團(tuán)。

8.用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的 用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的組合物，以及PCR反應(yīng)試劑、基因組提取液、基因組甲基化處理 液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品中的一種或者多種。

9.用于檢測(cè)SEPT9基因甲基化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)取患者靜脈血液，分離血漿，提取血漿DNA，作為待檢測(cè)樣本DNA；

2)利用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化甲基化區(qū)域；

3)在檢測(cè)體系中加入待檢測(cè)樣本的DNA、所檢測(cè)基因?qū)?yīng)的檢測(cè)引物對(duì)和檢測(cè)探針、阻 攔序列、用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因的內(nèi)標(biāo)引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)探針以及PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽(yáng) 性對(duì)照、陰性對(duì)照，通過(guò)熒光定量PCR的結(jié)果分析SEPT9基因甲基化清況；或者，在檢測(cè)體系 中加入待檢測(cè)樣本的DNA、所檢測(cè)基因?qū)?yīng)的檢測(cè)引物對(duì)、用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因的內(nèi)標(biāo)引物 對(duì)、PCR反應(yīng)試劑和熒光嵌入劑進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，通過(guò)熒光定量PCR的 結(jié)果分析SEPT9基因甲基化清況。