[發明專利]一種侯鉤藤的分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201610029165.0
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105506132B
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 朱爽;王業勝;曾常青;周林;李奇威
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林瑞云

本發明公開了一種侯鉤藤的分子鑒定方法。本發明在首次獲得侯鉤藤的ITS序列（如SEQ ID NO.1所示）的基礎上，以待測樣品的總DNA為模板，利用引物ITS5和ITS4擴增得到待測植物的rDNA ITS序列；將rDNA ITS序列與SEQ ID NO.1所示序列進行比對分析，具體是找出匹配后的12位、86位、105位、120位、450位、547位或569位的堿基中的至少2個堿基進行比對，根據比對結果鑒定待測樣品是否為侯鉤藤。上述位點是侯鉤藤區分于鉤藤屬其他種植物的唯一性位點信息，可在分子生物學水平對侯鉤藤進行快速、準確的分子鑒定；為中藥鉤藤的規范用藥、安全用藥提供了必要保障。

技術領域

本發明屬于分子鑒定技術領域。更具體地，涉及一種侯鉤藤的分子鑒定方法。

背景技術

侯鉤藤(Uncaria rhynchophylloides)是茜草科鉤藤屬植物，鉤藤屬植物主要分布于我國貴州、云南、廣東、廣西等地區，為中醫常用藥，藥用歷史悠久。《本草綱目》記載：“鉤藤，手、足厥陰藥也。足厥陰(肝經)主風，手厥陰(心包經)主火，鉤藤通心包于肝木，風靜火熄，則諸癥自除”。具有息風定驚，清熱平肝的功效。化學成分研究表明，鉤藤中主要有效成分為生物堿，但不同種鉤藤的藥效成分有一定的差別。由于鉤藤藥材的廣泛應用，來源比較復雜，且各品種間外形及其相似，加之某些地區的品種瀕危，導致市場上出現互混、互代、以次充好的現象，影響了用藥的安全性和有效性。

目前，中藥鉤藤的分類鑒定主要依據形態學、組織學和化學成分分析等傳統方法。由于鉤藤各品種間的外形及其相似，所以難以從藥材外觀形態上進行快速準確的鑒定其種類；而且通過根莖的解剖特征和化學成分分析方法亦難以鑒定其基原。因此，需要一種能夠對鉤藤屬植物進行更精確，更快速的鑒定方法。

ITS(Internal Transcribed Spacer)區序列是核糖體轉錄間隔區序列，在編碼核糖體RNA的核糖體DNA上，按照18S、5.8S、28S的順序縱向排列，而18S和5.8S、5.8S和28S之間的序列就是ITS序列。隨著分子生物學和生物信息學的快速發展，應用ITS區序列對藥用植物進行種類鑒定和種間分類已逐漸成為中藥分類學的研究熱點。目前，國內外尚未有侯鉤藤(Uncaria rhynchophylloides)分子鑒定的報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有依據形態學、組織學和化學成分分析等傳統方法對侯鉤藤(Uncaria rhynchophylloides)鑒定的缺陷和不足，提供一種用于侯鉤藤鑒定的準確性高而且快速的分子生物學方法。利用鉤藤屬植物核糖體DNA的ITS區域堿基序列的種特異的多態性，鑒別待測樣品是侯鉤藤(Uncaria rhynchophylloides)或者不是侯鉤藤。

本發明的目的是提供一種侯鉤藤的分子鑒定方法。

本發明另一目的是提供上述分子鑒定方法在侯鉤藤的鑒定中的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

本發明經過大量的研究實驗，得出了侯鉤藤的ITS序列，序列如SEQ ID NO.1所示。

上述ITS序列在鑒定侯鉤藤(Uncaria rhynchophylloides)方面的應用也在本發明的保護范圍之內。

一種侯鉤藤的分子鑒定方法，包括如下步驟：

S1.以待測樣品的總DNA為模板，利用引物ITS5和ITS4擴增得到待測植物的rDNAITS序列；

S2.將上述rDNA ITS序列與權利要求1中SEQ ID NO.1所示序列進行比對分析，具體是找出匹配后的12位、86位、105位、120位、450位、547位或569位的堿基中的至少2個堿基進行比對，根據比對結果鑒定待測樣品是否為侯鉤藤(鉤藤屬植物的ITS的起始部位的序列為5’-TCGAATCCTG)；