[發明專利]利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的方法

在審

• 申請號: 201610028875.1
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105543371A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 王光鋒;李舫;靖吉強;王傳春;王彩霞;袁東芳
• 申請（專利權）人: 山東畜牧獸醫職業學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及藥效檢測技術領域，具體為一種利用實時熒光定量PCR技術 獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的方法。

背景技術

目前，隨著養殖業的規模化發展，禽病的發生變得越來越復雜，靠疫苗 和藥物已經不能阻止疫病的發生，如何增強家禽機體自身的免疫功能變的越 來越重要。中藥免疫增強劑是近年來研究與應用得比較多的中藥免疫制劑， 中草藥主要通過對機體免疫器官發育的促進效果，增加非特異性免疫和特異 性免疫等，從而增強機體的免疫能力。中藥的免疫增強作用與其活性物質有 關，多糖是許多中藥的主要免疫活性物質，中草藥多糖是增強機體免疫的物 質基礎，對促進和恢復機體免疫機能的效果最為明顯。目前對于中草藥多糖 免疫增強效果的檢測，主要依靠血清學試驗檢測抗體、動物回歸試驗檢測各 項生活指標，如測定中性粒細胞的吞噬功能、T淋巴細胞轉化率等。這些方法 繁瑣費時、靈敏度不高、工作量大、效率低。

實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一種在DNA擴增反 應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。 通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。具 有快速高效、靈敏度高、特異性強等特點。經過對現有技術的文獻檢索，未 發現有利用實時熒光定量PCR來獲取多糖類中藥對家禽免疫增強作用中間信 息的方法，因此建立熒光實時定量PCR檢測多糖類中藥對家禽免疫增強作用 的方法十分必要。

發明內容

本發明所解決的技術問題在于提供利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖 類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，從而解決上述背景技術中 的問題。

本發明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現：

利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中 間信息的方法，包括如下步驟：

(1)提取動物血液樣品的基因組RNA；

(2)將步驟(1)所得的基因組RNA反轉錄為cDNA；

(3)在熒光定量PCR反應體系中分別加入β-actin引物、IL-2引物(即 白介素-2引物)、步驟(2)得到的cDNA以及熒光染料反應液，混勻，進行 PCR擴增；

(4)PCR擴增結束后，根據熒光實時定量PCR專用儀對結果進行分析， 根據IL-2和β-actin基因的Ct值，通過相對Ct法即2^–ΔΔCt法，來計算IL-2基 因mRNA的相對表達量，所述IL-2基因mRNA的相對表達量即為多糖類中 藥對動物免疫功能增強效果中間信息。

本領域技術人員應該知曉，IL-2基因mRNA的相對表達量，無法直接得 出動物的健康狀況。但是IL-2基因mRNA的相對表達量卻在一定程度上反映 了動物免疫系統的活度，對于多糖類中藥是否對家禽免疫功能起到增強效果 起到一定的指示作用。因此，通過實時熒光定量PCR技術來檢測IL-2基因 mRNA的相對表達量，可以獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用的中間 信息。

綜上所述，本發明直接目的并不是獲得診斷結果或健康狀況，而只是對 脫離動物體的血液樣品進行處理或檢測，以獲取作為中間結果的信息和方法。 獲取的中間信息能作為反映多糖類中藥是否對家禽免疫功能具有增強作用及 作用大小的輔助性手段。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述步驟(1)中的動物血液樣品 是指動物飼喂多糖類中藥后獲取的離體血液樣品。

本發明中，作為一種進一步優選的技術方案，所述步驟(1)中的動物血 液樣品是指雞飼喂多糖類中藥后的獲取的離體血液樣品。

本發明中，作為一種進一步優選的技術方案，所述多糖類中藥包括黃芪 多糖、香菇多糖和枸杞多糖中的一種或幾種。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述步驟(3)中，β-actin引物 包括

β-actin引物1：5’-GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3’和

β-actin引物2：5’-CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3’。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述步驟(3)中，IL-2引物包括

IL-2引物1：5’-GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3’和