[發明專利]利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的方法

在審

• 申請號: 201610028875.1
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105543371A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 王光鋒;李舫;靖吉強;王傳春;王彩霞;袁東芳
• 申請（專利權）人: 山東畜牧獸醫職業學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用 中間信息的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)提取家禽血液樣品的基因組RNA；

(2)將步驟(1)所得的基因組RNA反轉錄為cDNA；

(3)在熒光定量PCR反應體系中分別加入β-actin引物、IL-2引物(即 白介素-2引物)、步驟(2)得到的cDNA以及熒光染料反應液，混勻，進行 PCR擴增；

(4)PCR擴增結束后，根據熒光實時定量PCR專用儀對結果進行分析， 根據IL-2基因和β-actin的Ct值，通過相對Ct法即2^–ΔΔCt法，來計算IL-2基 因mRNA的相對表達量。

2.根據權利要求1所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的家 禽血液樣品是指家禽飼喂多糖類中藥后的獲取的離體血液樣品。

3.根據權利要求2所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的家 禽血液樣品是指雞飼喂多糖類中藥后的獲取的離體血液樣品。

4.根據權利要求3所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述多糖類中藥包括 黃芪多糖、香菇多糖和枸杞多糖。

5.根據權利要求4所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述步驟(3)中， β-actin引物包括

β-actin引物1：5’-GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3’和

β-actin引物2：5’-CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3’。

6.根據權利要求5所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 動物免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，IL-2 引物包括

IL-2引物1：5’-GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3’和

IL-2引物2：5’-AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3’。

7.根據權利要求6所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，所 述熒光定量PCR反應體系中β-actin引物、IL-2引物的濃度均為0.1～ 0.5μmol/L；PCR擴增時變性溫度為94～95℃，反應時間為1min；退火溫度 為58～61℃，反應時間為1min；循環數為35～45。

8.根據權利要求7所述的利用實時熒光定量PCR技術獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，其特征在于：所述熒光定量PCR反 應體系中β-actin引物、IL-2引物的濃度均為0.2μmol/L；PCR擴增時變性溫 度為95℃，反應時間為1min；退火溫度為60℃，反應時間為1min；循環數 為40。