[發明專利]一種抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA

有效

• 申請號: 201610028696.8
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105462983B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 賀浩華;胡麗芳;劉世強;朱昌蘭;歐陽林娟;彭小松;陳小榮;賀曉鵬;傅軍如;邊建民;徐杰;孫曉棠;周大虎
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/12
• 代理公司: 北京盛詢知識產權代理有限公司 11901
• 代理人: 張海青

本發明涉及一種抑制水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的amiRNA，公開了一種沉默水稻呼吸爆發氧化酶OsRboh的amiRNA序列，其序列為：TTAAACAACCGAAGGATACGC。本發明通過人工合成OsRboh(LOC_Os01g25820)?amiRNA序列并連接到表達載體上并轉化水稻，獲得的轉基因水稻植株葉片變為白色，育性降低。利用本發明制備的水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)amiRNA能高效靶向水稻目標基因，在基礎研究和生產實踐上具有一定的意義。

技術領域

本發明涉及一種抑制OsRboh(LOC_Os01g25820)基因表達的amiRNA及應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）是一類生物體有氧代謝的副產物，一方面可以作為有毒的次生代謝物對體內正常分子產生破壞作用；另一方面作為重要的信號分子參與生物體的生長和發。研究發現，ROS?的來源包括質膜NADPH?氧化酶、過氧化物酶及胺氧化酶，其中由NADPH?氧化酶介導產生的ROS?最受關注。

植物NADPH?氧化酶又稱呼吸爆發氧化酶（Respiratory?burst?oxidasehomologue，Rboh），是哺乳動物巨噬細胞NADPH?氧化酶催化亞基gp91phox?的同源物。?目前的研究表明，植物Rboh?基因的功能主要集中于兩個方面：參與脅迫反應和調控生長發育。本塞姆氏煙草植株（Nicotiana?benthamiana）中NbRbohA?或NbRbohB?基因沉默后，轉基因植株的ROS?生成量降低，同時，對致病疫霉菌（Phytophthora?infestans）的抗性降低，且過敏反應受到抑制。馬鈴薯中stRbohA?參與受傷后超氧根離子O2-·的產生，其在馬鈴薯塊莖的傷口愈合及抗微生物感染中起作用番茄反義Rboh?植株中ROS?的生成量明顯下降，同時植株的側枝增加，花序和花數量為野生型的2-3?倍，花瓣多于6?瓣，胚珠和花柱的形狀變得扁平。大麥HvrRbohA?反義轉基因植株表現出分蘗變少，育性降低。西瓜CcRboh?基因的表達水平在種子萌發后的3?d?達到最高，推測其可能在根的發育中起作用。

microRNA?(miRNA)是真核生物細胞內還存在一類長19-21個核苷酸的單鏈小RNA分子。莖環狀premiRNA是miRNA的前體，premiRNA進入細胞后被Dicer酶識別，剪切修飾后得到miRNA。miRNA結構有一段錯配序列，這使得miRNA不能與目的mRNA完全互補配對，導致目的mRNA無法被降解。miRNA可以與目的mRNA的3’端UTR結合，以阻礙蛋白翻譯的方法達到沉默目的基因的目的。amiRNA即人工合成微RNA(artificial?microRNA，amiRNA)，是以生物內源性的miRNA前體分子為骨架，依據體內miRNA的形成過程，采用基因合成的方法合成能夠沉默目的基因的微RNA。amiRNAi具有特異性高、穩定性強和沉默效果可控等優點，amiRNA可以特異沉默基因家族中的某一個靶基因的表達，而不影響其它成員從而越來越受到人們的關注。

水稻(Oryza?sativa?L.)?是最主要的糧食作物之一，全世界超過一半的人口都以水稻作為主糧。水稻不僅是一種重要的糧食作物，也是一種重要的模式生物，對相關基因進行功能研究具有重要作用。隨著水稻功能基因組研究的不斷深入，許多重要農藝性狀相關基因相繼被分離。Respiratory?Burst?Oxidase?Homolog?(Rboh)?基因直接參與ROS的形成，但在水稻中的功能并不清楚。鑒于ROS植物生長中的重要作用，獲得相應的功能缺失突變體進行研究具有一定的理論和實踐意義。盡管目前普通采用RNAi技術具有高效、直接等優點，但其主要的缺點是可同時沉默目的基因家族的其它同源性較高的基因，出現脫靶效應，很難對目的基因進行特異性沉默。因此，采用amiRNA技術針對特異的靶序列可以解決這一難題。本研究利用獲得的OSBROH?amiRNA序列構建載體水稻，獲得的轉基因水稻植株葉片變為白色，育性降低，在基礎研究和生產實踐上具有一定的意義。

發明內容